湖棲鰭蝦虎魚在發(fā)育生物學(xué)綜合性實驗中的應(yīng)用初探

王中鐸+郭昱嵩+劉皓+劉麗+劉楚吾

【摘 要】以湖棲鰭蝦虎魚為實驗材料，從受精、正常胚胎發(fā)育過程的觀察，環(huán)境因素對胚胎發(fā)育的影響，內(nèi)分泌干擾物的濃度梯度刺激對胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察及相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測等一系列連續(xù)實驗的設(shè)計，可為生物科學(xué)專業(yè)發(fā)育生物學(xué)的綜合性實驗設(shè)計提供參考，使學(xué)生掌握一系列發(fā)育生物學(xué)的基本實驗技術(shù)，增強學(xué)生對知識的理解層次，培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣。

【關(guān)鍵詞】發(fā)育生物學(xué)；綜合性實驗；湖棲鰭蝦虎魚

發(fā)育生物學(xué)的產(chǎn)生是以胚胎學(xué)為基礎(chǔ)，并融入分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的相關(guān)知識和技術(shù)，從20世紀(jì)70年代開始形成一門獨立的學(xué)科，近年來取得了巨大進展，成為解釋生物個體發(fā)育的基礎(chǔ)學(xué)科，也成為生命科學(xué)領(lǐng)域最活躍的學(xué)科之一。國內(nèi)外各高等院校紛紛開設(shè)發(fā)育生物學(xué)作為本科生的專業(yè)基礎(chǔ)課程，并開設(shè)實驗教學(xué)課程以增加學(xué)生理解層次及培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維和綜合素質(zhì)[1-3]。發(fā)育生物學(xué)實驗內(nèi)容包括生殖細(xì)胞的發(fā)生、受精、個體發(fā)育的過程、功能基因表達(dá)基因調(diào)控的機制和原理、發(fā)育與環(huán)境的關(guān)系、凋亡和再生、發(fā)育與進化等等；同時吸納了分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)等很多領(lǐng)域的研究手段。發(fā)育生物學(xué)發(fā)展速度快、但架構(gòu)不成熟。相比其他生物學(xué)分支學(xué)科，發(fā)育生物學(xué)實驗教學(xué)還處于剛剛起步階段，統(tǒng)一的、可廣泛接受和采納的教學(xué)體系還沒有形成[4]。傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容中相當(dāng)比重來源于胚胎學(xué)實驗，主要是作為理論教學(xué)的補充，以驗證性實驗為主，而綜合性、設(shè)計性的實驗內(nèi)容相對比較少，對學(xué)生綜合素質(zhì)、創(chuàng)新能力的培養(yǎng)沒有得到足夠重視[5]。通過綜合性的實驗，能夠充分發(fā)揮實驗教學(xué)作用，使學(xué)生從準(zhǔn)備實驗材料、藥品試劑到具體實驗操作的整個實驗教學(xué)過程中都基本能獨立完成，掌握發(fā)育生物學(xué)的基本實驗技術(shù)，并且能養(yǎng)成和增強學(xué)生良好的創(chuàng)新思維習(xí)慣，從而提高發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力[6]。但是，至目前為止，由于受到專業(yè)領(lǐng)域和實驗條件的限制，開設(shè)發(fā)育生物學(xué)實驗課程的高等院校還是比較少，難以實現(xiàn)和達(dá)到發(fā)育生物學(xué)的實驗?zāi)繕?biāo)和對理論課的輔助作用。廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院自2002年起對海洋生物學(xué)專業(yè)本科生開設(shè)了發(fā)育生物學(xué)理論課及實驗課，并且不斷改革進行和完善發(fā)育生物學(xué)實驗教學(xué)體系，于2009年開設(shè)了以硬骨魚類（如金魚、胡子鯰）和兩棲類（如虎紋蛙等）為實驗材料的適合于水產(chǎn)類的發(fā)育生物學(xué)綜合性實驗，取得了較好的教學(xué)效果，但由于實驗材料的可操控性不強，使得實驗開設(shè)的成功率和有效率降低[7]。

由于模式生物具有生理特征能夠代表生物界的某一大類群、容易獲得并易于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖及容易進行實驗操等優(yōu)點。為了不受限于實驗材料，基于模式生物的《發(fā)育生物學(xué)》實踐教學(xué)改革勢在必行。至今廣泛使用的水產(chǎn)魚類模式主要有源自亞洲其他地區(qū)的斑馬魚、日本青鳉魚，北美洲的三棘刺魚等。以斑馬魚為例，該淡水魚類原分布于本魚分布于孟加拉，印度，巴基斯坦，緬甸，尼泊爾的溪流。上世紀(jì)50年代開始被引進美國、德國等實驗室進行開發(fā)應(yīng)用。現(xiàn)已成為全世界廣泛接受的實驗?zāi)Ｐ椭弧＞C合而言，一方面斑馬魚具有模式生物共有的特點： 1）作為觀賞魚類之一，容易獲得并易于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖；2）受精后3天即可發(fā)育出膜，7天開口攝食，3個月既可完全成熟，世代短；3）3-5天可以產(chǎn)卵一次，每次可以產(chǎn)多達(dá)200顆成熟卵，因此子代多；4）其基因組已經(jīng)測定，且已經(jīng)建立許多純系，因而遺傳背景清楚；5）容易進行實驗操作，特別是具有遺傳操作的手段和表型分析的方法。另一方面，斑馬魚具有自身獨有特色，有利于回答研究者關(guān)注的問題：1）能夠很好代表生物界脊椎動物最大的水生硬骨魚類中的淡水鯉科類群；2）不會像鼠類、靈長類等導(dǎo)致人類的過敏等影響，對人體和環(huán)境無害；3）受精卵到出膜早期均透明，容易觀察和操作。

為了更好的與本土資源開發(fā)和利用研究相結(jié)合，本文利用本地紅樹林海區(qū)的廣鹽性魚類湖棲鰭蝦虎魚作為潛在的模式生物開發(fā)，輔助斑馬魚、青鳉為研究對象進行發(fā)育生物學(xué)綜合性實驗教學(xué)的改革探索。

湖棲鰭蝦虎魚（Gobiopterus lacustris）是本實驗室對廣東省雷州半島主要紅樹林海區(qū)進行魚類資源調(diào)查時發(fā)現(xiàn)的中國鰭蝦虎魚屬一新紀(jì)錄。于高橋鎮(zhèn)紅樹林保護區(qū)，東海島紅樹林海區(qū)，雷州市調(diào)風(fēng)鎮(zhèn)九龍山紅樹林國家濕地公園，附城鎮(zhèn)北家村，下六鎮(zhèn)紅蒔地村等附近的河流入海口或淺灘中均發(fā)現(xiàn)有湖棲鰭蝦虎魚的分布，并經(jīng)COI基因區(qū)段測序分析確認(rèn)[8]。成魚魚體半透明，無色或淡黃色，可以清晰地看見脊椎骨、肋骨、魚鰾、腸和性腺等腹部的器官。雌魚性腺中成熟的卵細(xì)胞清晰可見，也可看雄魚成熟性腺呈黃色。上、下頜圍有深色花斑，頭部分散著許多黑色花斑或斑點。背面上背鰭兩側(cè)各有一行斑點從頭部直通尾部。腹鰭、腹部和臀鰭兩側(cè)均有花斑。腹部向后，沿著髓棘和肋骨均分布有花斑。每一條鰭棘或鰭條上均分布有斑紋。可以通過生殖乳突、牙齒、性腺等形態(tài)學(xué)指標(biāo)區(qū)分雌雄成魚個體。

分布于雷州半島的湖棲鰭蝦虎魚數(shù)量多，且半島兩側(cè)均有分布，是這一地區(qū)的優(yōu)勢種[9]。由于湖棲鰭蝦虎魚生活在淡水與海水交匯的紅樹林海區(qū)，因此其適應(yīng)的鹽度較廣，其個體小易養(yǎng)殖，體色半透明，用肉眼或借助體式顯微鏡就能觀察到體內(nèi)變化情況，相比較于斑馬魚、青鳉等現(xiàn)有的模式生物，湖棲鰭蝦虎魚成體優(yōu)勢明顯，具有開發(fā)為模式生物或環(huán)境指示物種的潛力。

湖棲鰭蝦虎魚易于人工養(yǎng)殖，已經(jīng)開發(fā)完善了一套較為完備實驗室養(yǎng)殖規(guī)程。具體如下：養(yǎng)殖水體要經(jīng)尼龍、生物吸附劑、活性炭、生化過濾器及紫外殺菌系統(tǒng)處理， 溶解氧水平為4-8mg/L，水溫為26-30℃。養(yǎng)殖生長期為0.2-0.5L/尾。在實驗室培養(yǎng)下成活率高，溫度鹽度耐受性廣。缺點在于截至目前，該魚尚無法完成實驗室的全人工繁育過程，需要在野外采集成熟雌雄個體進行自然產(chǎn)卵。將幾種模式魚類可以進行優(yōu)勢互補，對實驗進行多角度分析。

與斑馬魚、青鳉魚相比，湖棲鰭蝦虎魚的優(yōu)勢在于從魚卵發(fā)育到成魚不用化學(xué)處理均呈現(xiàn)透明狀態(tài)，非常方便在體式鏡下觀察發(fā)育過程。湖棲鰭蝦虎魚作為實驗材料的優(yōu)勢在于胚胎發(fā)育歷程遵循硬骨魚類發(fā)育的模式，經(jīng)歷受精激活期、胚盤期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期這八個階段，各個時期都有明顯的特征，可以完整的跟蹤觀察胚胎到完全發(fā)育為仔魚的過程。尤其，基于湖棲鰭蝦虎魚的透明成體，可以方便我們進行活體條件下成體性腺、肝臟等內(nèi)臟器官的形態(tài)追蹤觀察，對科研教學(xué)有很好的意義[9]。endprint

針對湖棲鰭蝦虎魚的這些特點，我們設(shè)計開展發(fā)育生物學(xué)觀察實驗。首先，讓學(xué)生通過與斑馬魚沉性卵的比較，充分認(rèn)識湖棲鰭蝦虎魚的粘性卵特點，并思考和討論不同魚類受精卵的生態(tài)適應(yīng)和演化機制；其次，通過受精卵不同鹽度下的孵化速率和出膜率的比較，認(rèn)識廣鹽性魚類對于鹽度的適應(yīng)性發(fā)育能力；再次，比較不同模式魚類之間出膜時間周期，出膜后魚體的發(fā)育程度和仔魚的活動能力；第四，充分利用湖棲鰭蝦虎魚成體透明的特點，觀察從仔稚魚到成體轉(zhuǎn)變過程中內(nèi)部器官的轉(zhuǎn)變過程，以及攝食等不同生活狀態(tài)下消化系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)的運作；最后，觀察性成熟的雌雄個體性腺在不同發(fā)育分期下的形態(tài)轉(zhuǎn)變，為毒理學(xué)實驗打基礎(chǔ)。

我們還針對湖棲鰭蝦虎魚設(shè)計急性和慢性毒理實驗。急性實驗方面，使用較大濃度的壬基酚等典型的近岸常見污染物處理湖棲鰭蝦虎魚，然后觀察形態(tài)改變，行為異常并獲取半致死濃度等數(shù)據(jù)。慢性實驗方面，使用較低的不同劑量濃度壬基酚等處理湖棲鰭蝦虎魚。考慮到慢性實驗周期較長，我們需要設(shè)置多個觀測時間點，安排在課程的多個階段，分別開展多方面的實驗，具體包括：觀察記錄外部形態(tài)以及肝臟、性腺等內(nèi)臟狀態(tài)、測量相應(yīng)的長度和重量；測定抗氧化氣化酶等常規(guī)酶變化；qPCR定量ChgL等基因的表達(dá)。通過急慢性的毒理學(xué)實驗，是學(xué)生能夠全面認(rèn)識內(nèi)分泌干擾物的暴露對魚類個體發(fā)育不同階段的影響，從而充分認(rèn)識環(huán)境保護工作的重要性。

根據(jù)發(fā)育生物學(xué)實驗的教學(xué)要求，通過以實驗室方便人工養(yǎng)殖和操控觀察的硬骨魚類湖棲鰭蝦虎魚為材料，從受精、正常胚胎發(fā)育過程（包括內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)）、環(huán)境因素對胚胎發(fā)育的影響、內(nèi)分泌干擾素濃度梯度對胚胎的影響以及檢測胚胎發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達(dá)水平等，設(shè)計一系列連貫實驗讓學(xué)生進行操作，可為發(fā)育生物學(xué)的綜合性實驗設(shè)計及本科生開放實驗項目提供參考。通過以上的實驗，使得學(xué)生掌握一整套發(fā)育生物學(xué)的實驗技術(shù)，增強學(xué)生的科研興趣，培養(yǎng)學(xué)生的科研素養(yǎng)，提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力。

【參考文獻】

[1]丁漢波，全允翔，黃浙.發(fā)育生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，1987.

[2]樊啟昶，白書農(nóng).發(fā)育生物學(xué)原理[M].北京：高等教育出版社，2002.

[3]張祥沛，郭炳冉.生物學(xué)實驗研究[M].2版.青島：中國海洋大學(xué)出版社，2000.

[4]董巍，張媛，許崇任.改革創(chuàng)新發(fā)育生物學(xué)實驗教學(xué)的實踐與思考[J].高校生物學(xué)教學(xué)研究，2014，4（1）：46-50.

[5]郭炳冉，鮑淑蘭.規(guī)范發(fā)育生物學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容的思考[J].實驗技術(shù)與管理，2008，25（9）：23-24.

[6]李登文，周軍.細(xì)胞生物學(xué)綜合性實驗的設(shè)計[J].實驗室研究與探索，2008，27（4）：100-101.

[7]劉皓，劉麗，李鋒，郭昱嵩，劉楚吾.海洋生物專業(yè)發(fā)育生物學(xué)綜合性實驗設(shè)計初探——硬骨魚的人工催青、受精、早期胚胎發(fā)育及其調(diào)控[J].湛江師范學(xué)院學(xué)報， 2014，35（5）：1-3.

[8]廖健，張順，龍水生，等.5種蝦虎魚類線粒體COI基因序列變異及系統(tǒng)進化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2016，36（1）：7-12.

[9]廖健，張順，賀亮，等.基于DNA條形碼技術(shù)的雷州半島紅樹林海區(qū)仔稚幼魚物種多樣性研究.第三屆環(huán)北部灣高校研究生海洋論壇[C].湛江：廣東海洋大學(xué)， 2015：175-183.

[責(zé)任編輯：朱麗娜]endprint