烤煙‘K326’抗TMV防御物質初探

周文兵, 計思貴, 李江舟, 崔永和, 黃智華, 張立猛*

(1. 云南省煙草公司玉溪市公司, 玉溪 653100; 2. 煙草行業病蟲害生物防治工程研究中心, 玉溪 653100)

烤煙‘K326’抗TMV防御物質初探

周文兵1,2, 計思貴1, 李江舟1,2, 崔永和1,2, 黃智華1,2, 張立猛1,2*

(1. 云南省煙草公司玉溪市公司, 玉溪 653100; 2. 煙草行業病蟲害生物防治工程研究中心, 玉溪 653100)

烤煙主栽品種‘K326’在打頂后,隨著次生代謝產物的積累,煙草花葉病癥狀呈減輕趨勢。本試驗利用半葉枯斑法對‘K326’的全株、根、莖、葉甲醇提取物及根部不同極性溶劑萃取物進行抗煙草普通花葉病毒活性篩選,結果表明:在濃度為1 mg/mL時,‘K326’各部位甲醇提取物中,根部甲醇提取物的活性最強,對TMV體外鈍化、初侵染和復制增殖作用的抑制率分別為74.50%、68.82%和47.76%;利用不同極性溶劑對根部甲醇提取物萃取處理后,乙酸乙酯萃取物活性增強明顯,對TMV體外鈍化、初侵染和復制增殖作用的抑制率分別為76.81%、78.02%、61.42%;經普通煙‘K326’進一步驗證,根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物活性最強。綜上,‘K326’中抗病毒防御物質可能存在于根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中。

烤煙提取物; 煙草花葉病毒(TMV); 抑制活性

煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus, (TMV)作為世界上最先發現并確定的病毒,嚴重危害煙葉的產量和質量,給煙農造成了巨大的經濟損失[1-3]。由于植物病毒對寄主細胞具有絕對寄生性,病毒傳播方式具有多樣性,且植物缺乏完整的免疫系統,因而高效抗病毒劑的開發存在極大困難,至今尚未有理想的防治藥劑[4]。目前采用的農業防治措施存在較大的局限性,化學防治則易引發環保問題,于是人們把目光轉向了抗TMV 天然產物的研究與開發[5-7]。

‘K326’是我國主栽烤煙品種,煙草花葉病是該品種的主要病害之一,經多年觀察,我們發現烤煙‘K326’在打頂后,隨著次生代謝產物的積累,煙草花葉病癥狀呈明顯減輕趨勢。因此,有必要對‘K326’中煙草花葉病的抗性物質進行系統研究,為‘K326’高感花葉病尋求一條新的解決途徑的同時,也可以進一步拓寬煙草的使用空間。

本研究從煙草內源性抗煙草花葉病次生代謝物質出發,利用半葉枯斑法對‘K326’的全株、根、莖、葉甲醇提取物及根部不同極性萃取物進行抗煙草花葉病毒活性篩選,并用圓盤懸浮篩選法對篩選結果進行驗證,為‘K326’中抗煙草花葉病的物質基礎研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 煙草的培育

以心葉煙NicotianaglutinosaL.和普通煙NicotianatabacumL. ‘K326’為供試烤煙品種,煙草種子由玉溪中煙種子有限責任公司提供。將煙草種子播種于裝有基質的育苗盤,漂于育苗池中,于適宜條件下(溫度22±1℃,光照16 h/d,濕度60%) 培養,待幼苗長至三葉期移植于小花盆中, 每盆1株。試驗用苗均放置于(23±1)℃人工氣候箱中,光照和黑暗循環為12 h∥12 h,待長至4～6片真葉時供試[8]。

1.2 供試煙草樣品

‘K326’樣品由云南省煙草公司玉溪市公司烤煙生產技術中心提供,全株、根、莖和葉在烤煙打頂30 d后采收,樣品分別剁碎,50℃烘干,粉碎,過40目篩,室溫保存備用。

1.3 供試病毒

煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)普通株系,由云南省煙草農業科學研究院提供,由本實驗室保存于普通煙 ‘K326’上。保存毒源的煙草用紗網罩嚴,并單獨放置在25℃恒溫溫室中培養,溫室光照條件為L∥D=16 h∥8 h。培養過程中注意防蟲,嚴防其他病毒及病害對毒源的污染[9]。在開展抗病毒活性測定的當天按照下述方法提取 TMV 的粗提液,最大限度保證 TMV 活性。TMV 粗提液提取方法:選取幼嫩、新鮮的病葉 100 g,放置在研缽中,加入200 mL的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS, pH=7.2,內含1%的巰基乙醇),研磨過濾,取濾液并加入8%正丁醇,攪拌15 min,4℃、10 000 g離心30 min,取上清液,沉淀加入聚乙二醇3000(PEG3000)至終濃度4%,同時加NaCl至終濃度為3%,4℃放置1 h,4℃、10 000 g離心15 min,棄上清,沉淀溶于20 mL 0.01 mol/L PBS (pH=7.2) 緩沖液中,室溫攪拌2 h,4℃、10 000 g離心15 min,取上清,按每10 mL加入0.4 g的NaCl及0.4 g的PEG3000,邊加邊攪拌使其完全溶解,攪拌1 h,4℃、10 000 g離心30 min,取沉淀,按照原液每100 mL加入2 mL 0.01 mol/L PBS (pH=7.2),待沉淀完全溶解后,4℃ 10 000 g離心30 min。上清液即為TMV粗提液,保存到4℃冰箱備用[10]。病毒濃度用鮮葉質量(mg)與緩沖液的體積(L)比來定義,心葉煙接種濃度為20 mg/L,普通煙 ‘K326’接種濃度為50 mg/L。

1.4 樣品的制備

每樣稱取樣品粉末100 g,置1 L的三角燒瓶中,每次加入500 mL分析純甲醇,室溫下超聲提取3次,每次15 min,合并3次濾液,濃縮得粗提物[11]。待粗提物回收無醇味,加入少量純凈水使樣品混溶倒入分液漏斗,分別加入等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,每溶劑萃取5次,回收各萃取液得各極性段樣品,剩余水層回收得水提取物。稱取少量提取物(約100 mg),用少量二甲亞砜(DMSO)溶解后加水配成100 mg/mL的水溶液,按比例分別加水稀釋成10、1和0.1 mg/mL的水溶液,置于4℃冰箱備用[12-13]。對照藥劑為寧南霉素8%水劑按質量濃度配制成相應濃度的水溶液,寧南霉素8%水劑由上海豐農生物科技有限公司提供。

1.5 試驗方法

1.5.1 對TMV體外鈍化作用測定

采用半葉枯斑法[14]測定。選取生長旺盛的4～6葉期心葉煙,將濃度為1 mg/mL的‘K326’各提取物溶液和對應劑量的溶劑分別與等體積的TMV溶液混合鈍化30 min,然后分別摩擦接種于心葉煙左半葉和右半葉。待葉片干后用清水將葉片沖洗干凈。隨后在光照培養箱中保溫保濕培養,溫度(22±1)℃,光照12 h/d,濕度60%,3～4 d后觀察并記錄枯斑的數目。每處理3株,每株3～4片葉;每處理重復3次。

1.5.2 各提取物對TMV初侵染和復制增殖抑制作用測定

采用半葉枯斑法[14]測定。選取生長旺盛的4～6葉期心葉煙,初侵染試驗在左半葉涂施一定濃度的粗提物溶液,右半葉涂對應劑量的溶劑作對照。間隔12 h后再摩擦法全葉接種病毒;復制增殖作用先全葉摩擦接種病毒,待葉片干后12 h,左半葉涂施提取物溶液,右半葉涂施對應劑量的溶劑作對照。隨后在光照培養箱中保溫保濕培養,溫度(22±1)℃,光照12 h/d,濕度60%,3～4 d后觀察并分別記錄左右半葉枯斑的數目。每處理3株,每株3～4片葉;每處理重復3次。

1.5.3 各提取物對TMV在‘K326’體內增殖抑制活性測定

采用葉圓片懸浮篩選法[15-16]進行測定。用摩擦法接種TMV于‘K326’葉片,6 h后用清水沖洗葉片,2 h后(葉片淋洗水變干),用打孔器在接種葉片上切取直徑12 mm的圓盤。將接種面朝上,讓其漂浮在含不同濃度供試液的培養皿中,3 d后磨碎葉片,用間接ELISA法檢測病毒含量,并分別設藥劑空白接種病毒和不接種病毒的陽性和陰性葉片為對照。每處理6個圓盤。

1.5.4 結果計算與統計方法

(1)枯斑抑制率計算公式如下:

供試化合物對煙草花葉病的抑制率(%)計算公式為:抑制率(%)=[(對照枯斑數-處理枯斑數)/對照枯斑數]×100。

(2)病毒增殖抑制率計算公式如下:

病毒增殖抑制率(%)=[(藥劑空白陽性葉片對照病毒含量-藥劑處理葉片病毒含量)/ 藥劑空白陽性葉片對照病毒含量]×100。

2 結果與分析

2.1 ‘K326’提取物對TMV侵染活性的抑制作用

2.1.1 體外鈍化作用

從表1可見:用‘K326’各部位提取物溶液對病毒提取液鈍化處理后接種煙葉,‘K326’全株及根、莖、葉的甲醇提取物對TMV均表現出一定鈍化作用;根、莖部甲醇提取物活性高于全株提取物,抑制率分別為74.50%和37.56%;對根部甲醇提取物用不同極性溶劑萃取后,較根部甲醇提取物,乙酸乙酯萃取物活性稍有增強,對TMV侵染的抑制率達到76.81%,其他極性溶劑萃取物活性降低。

表1‘K326’不同部位提取物對TMV的鈍化作用1)

Table1InhibitioneffectsoftheextractsfromNicotianatabacum‘K326’againstTMV

處理Treatment枯斑數/個Locallesions處理Treatment對照Control抑制率/%Inhibitionrate全株甲醇提取物Themethanolextractofthewhole?plant21．031．533．33bc1根部甲醇提取物Themethanolextractofroot8．433．074．50a1莖部甲醇提取物Themethanolextractofstem25．641．037．56b1葉部甲醇提取物Themethanolextractofleaves33．045．026．67c1根部石油醚萃取物Thepetroleumetherextractofroot28．870．058．93b2根部乙酸乙酯萃取物Theethylacetateextractofroot15．767．676．81a2根部正丁醇萃取物Then?butanolextractofroot68．583．851．33b2根部水提取物Thewaterextractofroot27．343．336．93c28%寧南霉素水劑8%NingnanmycinAS563．392．10

1) 數字上標表示顯著性分析組別,不同字母表示組內差異顯著(P<0.05);下同。 Numeric superscript indicates the groups and different lowercase letters indicates significant difference (P<0.05); the same below.

2.1.2 保護作用

從表2可見:在TMV侵染過程中,‘K326’各部位的甲醇提取物對TMV寄主均表現出一定的保護作用,根和莖的甲醇提取物活性高于全株甲醇提取物,對TMV侵染抑制率分別達到68.82%和59.46%;對根部甲醇提取物用不同極性溶劑萃取后,較根部甲醇提取物,乙酸乙酯萃取物活性增強明顯,對TMV寄主的保護作用達到78.02%。

表2‘K326’不同部位提取物對TMV初侵染的抑制作用

Table2ProtectioneffectsoftheextractsfromNicotianatabacum‘K326’onprimaryinfectionofTMV

處理Treatment枯斑數/個Locallesions處理Treatment對照Control抑制率/%Inhibitionrate全株甲醇提取物Themethanolextractofthewhole?plant22．840．343．42c1根部甲醇提取物Themethanolextractofroot13．041．768．82a1莖部甲醇提取物Themethanolextractofstem15．037．059．46b1葉部甲醇提取物Themethanolextractofleaves28．038．126．51d1根部石油醚萃取物Thepetroleumetherextractofroot39．782．052．62b2根部乙酸乙酯萃取物Theethylacetateextractofroot19．890．178．02a2根部正丁醇萃取物Then?butanolextractofroot42．772．240．90c2根部水提取物Thewaterextractofroot46．063．227．20d28%寧南霉素水劑8%NingnanmycinAS13．045．771．55

2.1.3 治療作用

從表3可見:TMV侵染初期,除煙葉的甲醇提取物外,‘K326’各部位甲醇提取物對TMV侵染均表現出一定的治療作用,根和莖的甲醇提取物活性高于全株提取物,對TMV侵染的抑制率分別為47.76%和42.40%;對根部甲醇提取物用不同極性溶劑萃取后,較根部甲醇提取物,乙酸乙酯和石油醚萃取物對TMV侵染的治療作用明顯增強,抑制率分別為61.42%和53.78%。

表3‘K326’不同部位提取物對TMV復制增殖的抑制作用1)

Table3InhibitioneffectsoftheextractsfromNicotianatabacumonTMVproliferation

處理Treatment枯斑數/個Locallesions處理Treatment對照Control抑制率/%Inhibitionrate全株甲醇提取物Themethanolextractofthewhole?plant18．024．325．92b1根部甲醇提取物Themethanolextractofroot14．026．847．76a1莖部甲醇提取物Themethanolextractofstem16．027．842．40a1葉部甲醇提取物Themethanolextractofleaves35．529．0-根部石油醚萃取物Thepetroleumetherextractofroot31．167．353．78b2根部乙酸乙酯萃取物Theethylacetateextractofroot30．679．461．42a2根部正丁醇萃取物Then?butanolextractofroot64．277．417．05c2根部水提取物Thewaterextractofroot71．362．7-8%寧南霉素水劑8%NingnanmycinAS933．372．97

1) “-”表示沒有活性。 “-” indicates no inhibitory activity.

2.2 根部提取物對TMV增殖的抑制活性

為了進一步驗證‘K326’根部提取物對TMV的抑制活性,我們在普通煙‘K326’上采用圓盤懸浮篩選法對‘K326’根部甲醇提取物、乙酸乙酯、石油醚萃取物對TMV增殖的抑制活性進行測定。從圖1可見:通過0.1、1、10 mg/mL 3個濃度的篩選發現,隨著樣品濃度的提高,3個提取物對TMV增殖的抑制率逐漸提高,表現出顯著的劑量效應;3種濃度下,均以乙酸乙酯萃取物活性最強,石油醚萃取物活性最弱。

圖1 不同濃度‘K326’根部提取物對TMV增殖的抑制活性Fig.1 Inhibitory effects of different concentrations of the root extracts of ‘K326’ on TMV proliferation

3 討論

煙草中的化學成分極為復雜,近幾十年來,國內外研究者對煙草進行了大量研究,從中發現并鑒定的化學成分已有2 549種。同時,學者也從煙草中發現了具有抗病毒作用的活性物質,Cotelle等發現,煙草中酚類化合物對清除自由基作用良好,并且富含抗氧化活性[17-18]。流行病學研究表明,抗氧化化合物一般都具有一定的抗病毒活性[19-20]。Ohnishi等也發現煙草中含量較高的綠原酸的水解產物咖啡酸具有抑制單純皰疹病毒的功效[21]。德國Free大學Eich教授在研究植物次生代謝物作為抗逆轉錄病毒劑時,發現綠原酸及其衍生物具有較好的抗艾滋病毒(HIV)活性[21-22]。

以上研究主要是煙草中活性物質在抗人類疾病中的應用,但對其在對抗自然界逆境而形成的抵御病害的化學防御物質卻涉獵較少。本研究基于煙草種植過程中發現的自然現象,首次從化學防御角度對‘K326’在對抗TMV侵襲過程中產生的防御物質進行了初步研究。發現‘K326’的全株、根、莖和葉的甲醇提取物對TMV體外鈍化、初侵染和復制增殖均具有一定的抑制活性,根的甲醇提取物活性最強;對根部甲醇提取物用不同極性溶劑萃取后,較根部甲醇提取物,乙酸乙酯萃取物活性增強明顯,石油醚、水和正丁醇萃取物活性均不同程度降低;經對根部甲醇提取物、乙酸乙酯、石油醚萃取物活性進一步驗證,3個提取物均表現出明顯的劑量效應,乙酸乙酯萃取物活性最強。以上結果表明,‘K326’中抗TMV 化學防御物質可能存在于根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中,在今后的研究中我們將對根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物進行跟蹤提取分離鑒定,對其抗TMV 化學防御物質進一步研究發掘。

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(責任編輯： 田 喆)

Anti-TMVactivityoftheextractsfromtobacco‘K326’

Zhou Wenbing1,2, Ji Sigui1, Li Jiangzhou1,2, Cui Yonghe1,2, Huang Zhihua1,2, Zhang Limeng1,2

(1.YunnanTobaccoCompany,YuxiBranch,Yuxi653100,China; 2.ResearchCenterforApplicationTechnologyofBiologicalControlEngineeringforTobaccoDiseasesandInsectPestsofChinaTobacco,Yuxi653100,China)

The antiviral activity of the extract from ‘K326’ againstTobaccomosaicvirus(TMV) was determined by a half-leaf necrosis method. The methanol extracts from different parts of ‘K326’ showed good inhibitory activities against TMV at 1 mg/mL. Especially the methanol extracts from roots exhibited the best inhibitory activities on TMV inactivation, primary infection, and proliferation with an inhibition rate of 74.50%, 68.82% and 47.76%, respectively; the methanol extracts from roots were disposed with different organic solutions,i.e., petroleum ether, ethyl acetate andn-butanol; after that, the antiviral activity of the extracts with ethyl acetate increased significantly, with an inhibition rate of 76.81%, 78.02% and 61.42%, respectively. Further experiments on ‘K326’ suggested that the antiviral activity of the extracts of ethyl acetate was the best.

extraction from tobacco;Tobaccomosaicvirus(TMV); inhibitory activity

S 435.72

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.017

2016-10-25

： 2017-01-09

中國煙草總公司云南省煙草公司科技計劃項目(2015YN11)

* 通信作者 E-mail: zlm.d@163.com