微生物降解葡萄皮單寧研究

蘭平，馬澤宇,葉柳青,BROSSE Nicolas,CHRUSCIEL Laurent

(1.南京林業大學材料科學與工程學院，南京 210037； 2.法國洛林大學科學與技術學院，南錫 54500 法國)

微生物降解葡萄皮單寧研究

蘭平1，馬澤宇1,葉柳青1,BROSSE Nicolas2,CHRUSCIEL Laurent2

(1.南京林業大學材料科學與工程學院，南京 210037； 2.法國洛林大學科學與技術學院，南錫 54500 法國)

為降低葡萄皮單寧的分子量和聚合度，選取青霉(Penicilliumsp.)和米曲霉(Aspergillusoryzae)為微生物菌株對葡萄皮單寧進行生物降解。以兒茶素的生成量和轉化率為指標，分析碳源、氮源、時間、溫度、pH和誘導培養基中單寧質量濃度對降解效果的影響。結果表明：外加碳源和氮源有利于青霉和米曲霉菌株的生長；時間為葡萄皮單寧降解得到不同中間產物的關鍵參數；溫度、pH和葡萄皮單寧的質量濃度對菌株活性和降解能力均有不同程度影響；青霉對葡萄皮單寧的降解效果好于米曲霉。青霉最佳降解條件：培養時間24 h，溫度28℃，pH 6.5，單寧質量濃度12.5 g/L，兒茶素最大生成質量濃度0.32 mg/mL，轉化率52.3%；米曲霉最佳降解條件：培養時間36 h，溫度28℃，pH 6.5，單寧質量濃度10.0 g/L，兒茶素最大生成質量濃度0.16 mg/mL，轉化率32.2%。因此，可通過生物降解法調控葡萄皮單寧的化學組成，適當降低單寧的分子量和聚合度。

葡萄皮單寧；兒茶素；青霉；米曲霉；微生物降解

植物單寧是一種天然多酚類物質，分子量約為500～3 000 u，廣泛存在于植物的葉、莖和果實中，是一種重要的天然可再生資源。植物單寧按照結構特征不同，可分為水解類單寧和凝縮類單寧[1-3]。植物單寧的利用與單寧種類相關，凝縮類單寧占世界單寧產量的90%，主要應用于皮革和膠黏劑樹脂行業。利用凝縮類單寧代替從石化產品衍生物中提取的酚類生產膠黏劑始于1970年，可用于制備單寧基膠黏劑和代替苯酚改性酚類樹脂膠黏劑[4-7]。

植物單寧的降解主要有化學降解和生物降解兩種。與化學降解相比，生物降解具有環保、安全、成本低、易操控等優點。與水解類單寧相比，凝縮類單寧由于受本身結構特點的影響，生物降解較水解類單寧困難。但研究人員通過研究發現一些可降解凝縮類單寧的微生物，這類微生物主要為青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)中的某些種系，其中較常見的有黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、阿達青霉(Penicilliumadametzii)、青霉(Penicilliumsp.)等，它們可將單寧降解轉化成生長需要的能量[8-13]。此外，由植物體內植物單寧的生物合成途徑可知，植物體內的凝縮類單寧由兒茶素或棓兒茶素等黃烷醇單體縮聚而成[14-16]。由此推斷，在凝縮類單寧的生物降解過程中，凝縮類單寧首先被微生物降解為黃烷醇單體，然后再進一步降解為酚類和酸類等小分子物質。

葡萄皮渣為來源于葡萄酒加工行業的廢棄物，葡萄皮渣中單寧含量較高，約占葡萄皮的20%～30%。在前期研究工作中，采用亞硫酸鹽法從葡萄皮渣中提取單寧，研究結果表明，葡萄皮單寧主要由具有間苯三酚A環的原花青定和原翠雀定凝縮類單寧組成，部分原花青定結構上含有葡萄糖基取代基和沒食子酸取代基，此種葡萄皮單寧提取物可用于制備單寧膠黏劑。但由于單寧的分子量大、聚合度高、黏度大等特點導致膠黏劑的膠合性能較差[17-18]。因此，本研究選取青霉和米曲霉為微生物菌株對葡萄皮單寧進行生物降解，以原花青定類單寧的單體兒茶素的生成量和轉化率為指標，分析不同碳源和氮源、時間、溫度、pH和葡萄皮單寧質量濃度對青霉和米曲霉降解葡萄皮單寧的影響；采用生物降解法，通過控制降解條件，適當降低葡萄皮單寧的分子量和聚合度，以期在后續利用葡萄皮單寧制備單寧膠黏劑時，減少葡萄皮單寧在膠黏劑成膠縮聚反應中的空間位阻效應，增加交聯強度，提高單寧膠黏劑的成膠性能。

1 材料與方法

1.1 菌 種

青霉和米曲霉由本試驗誘變、篩選原始青霉和米曲霉菌株獲得，菌株在4℃條件下保存在蔗糖瓊脂斜面培養基上。

1.2 培養基

查氏培養基：NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·4H2O 0.01 g/L、K2HPO41.0 g/L、蔗糖30.0 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

誘導培養基：在查氏培養基中，加入一定質量濃度的葡萄皮單寧為誘導劑，在121℃條件下滅菌20 min。

1.3 葡萄皮栲膠制備

采用亞硫酸鹽法從葡萄皮渣中提取葡萄皮栲膠，以氫氧化鈉和亞硫酸鈉混合堿為提取劑，提取溫度為100℃，提取時間為120 min[18]。為提高葡萄皮栲膠中單寧的質量分數，使用丙酮溶劑對葡萄皮栲膠進一步純化。稱取一定量葡萄皮栲膠，溶于3倍質量的70%(體積分數)丙酮水溶液中，超聲提取60 min，離心得上層清液，殘渣再用3倍質量70%(體積分數)丙酮水溶液提取，離心后合并清液，真空濃縮干燥，得到最終葡萄皮栲膠固體粉末。葡萄皮栲膠中的凝縮類單寧和兒茶素的質量分數分別為56.8%和0.32%。

1.4 不同碳源和氮源對菌株生長的比較試驗

以查氏培養基為基礎，分別添加質量濃度為30.0 g/L的葡萄糖、乳糖和蔗糖為培養基的碳源，質量濃度為3.0 g/L的硝酸鈉、硝酸鉀和蛋白胨為培養基的氮源，取5 mL 各菌株懸浮液分別接入誘導培養基中，培養基中葡萄皮單寧質量濃度為10.0 g/L，取100 mL培養液，調節pH為6.5，28℃、120 r/min搖床培養，每間隔6 h取1瓶測定生物量。生物量以菌體濕質量計，每間隔6 h取一瓶培養液，離心20 min后測定菌體濕質量，分析不同碳源和氮源對菌株生長的影響。

1.5 不同時間、溫度和pH對菌株降解單寧的比較試驗

以查氏培養基為基礎，將5 mL菌株懸浮液分別接入誘導培養基中，培養基中葡萄皮單寧質量濃度為10.0 g/L，取100 mL培養液，調節培養基初始pH 6.5，28℃、120 r/min搖床培養，每隔6 h取樣測試培養液中兒茶素質量濃度和兒茶素轉化率，分析培養時間對菌株降解單寧的影響。

取100 mL培養液，調節培養基初始pH為6.5，分別設定溫度為20，25，28，30，32和35℃，120 r/min搖床培養一段時間后，取樣測試培養液中兒茶素質量濃度和兒茶素轉化率，分析溫度對菌株降解單寧的影響。

取100 mL培養液，調節培養基pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，28℃、120 r/min搖床培養一段時間后，取樣測試培養液中兒茶素質量濃度和兒茶素轉化率，分析初始pH對菌株降解單寧的影響。

1.6 不同單寧質量濃度對菌株降解單寧的比較試驗

以查氏培養基為基礎，將各菌株5 mL 懸浮液分別接入誘導培養基中，調節培養基中葡萄皮單寧質量濃度為5.0，7.5，10.0，12.5，15.0和17.5 g/L、取100 mL培養液，調節培養基初始pH 6.5，28℃、120 r/min搖床培養一段時間后，取樣測試培養液中兒茶素質量濃度和兒茶素轉化率，分析單寧質量濃度對菌株降解單寧的影響。

1.7 單寧和兒茶素測定

采用香草醛分光光度計法測定葡萄皮栲膠中凝縮類單寧質量分數[19-20]。配制一定質量濃度的葡萄皮栲膠甲醇溶液，經香草醛-鹽酸試劑顯色反應(50℃，20 min)后測其吸光度(A500)。

采用香草醛分光光度計和薄層色譜分離相結合方法測定葡萄皮栲膠和培養液中兒茶素含量[13,19]。以BAW(正丁醇∶乙酸∶水體積比為4∶1∶5)為展開劑，精確吸取50 μL葡萄皮栲膠待測樣品，在標準色譜紙(硅膠G60板)上點樣、展開和定位。以購買于Sigma 公司的兒茶素為標準樣品，配制一定質量濃度的兒茶素標準樣品，在標準色譜紙上點樣、展開和定位。以兒茶素標準樣品在色譜紙上定位點為參照，用甲醇洗脫葡萄皮栲膠在色譜紙上展開定位后兒茶素樣品對應的點，經香草醛-鹽酸試劑顯色反應后，測其吸光度(A500)。

以兒茶素標準樣品建立分光光度計法標準曲線，根據公式(1)計算葡萄皮栲膠中凝縮類單寧和兒茶素的質量分數，根據公式(2)計算培養液中兒茶素的質量濃度，根據公式(3)計算培養液中兒茶素的轉化率。

(1)

式中：C1為顯色后溶液的質量濃度，mg/mL；V0為栲膠的溶液體積，mL；V1為點樣體積，mL；V2為顯色后溶液的體積，mL；M0為栲膠的質量，mg。

(2)

(3)

2 結果與分析

2.1 碳源和氮源對菌株生長的影響

將加入不同碳源和氮源的誘導培養基在搖床上培養，測定不同培養時間的菌體濕質量，選取菌體濕質量達到最大值的培養時間，分析外加碳源和氮源對青霉和米曲霉菌株生長的影響。試驗結果表明，青霉的菌體濕質量在培養12 h后穩步上升，在36 h時達到最大值；米曲霉在培養12 h時菌體濕質量達到最高值，隨后緩慢減少。因此，青霉以培養36 h的菌體濕質量計，米曲霉以培養12 h的菌體濕質量計。不同碳源對微菌株生長的影響如圖1所示。由圖1可見，當青霉和米曲霉菌株僅以葡萄皮單寧為碳源時，兩種菌株的菌體濕質量均較低。當加入外加碳源后，菌體濕質量明顯增加，以蔗糖為外加碳源時，菌體濕質量最高。說明外加碳源有利于青霉和米曲霉菌株生長。不同氮源對微菌株生長的影響如圖2所示。由圖2可見，外加氮源也有利于菌體生長，在3種外加氮源中，蛋白胨的影響最大，其次為硝酸鈉，硝酸鉀的影響最弱。考慮到蛋白胨成本較高，選擇硝酸鈉為氮源。

圖1 不同碳源對微生物菌株生長的影響Fig.1 Effect of carbon source on growth of microbial strains

圖2 不同氮源對微生物菌株生長的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on growth of microbial strains

2.2 時間對菌株降解單寧的影響

培養時間對微生物降解葡萄皮單寧具有較重要影響，是單寧降解得到不同中間產物的關鍵參數。如降解時間不夠，單寧不能得到較好降解，仍以不同聚合度的黃烷醇類高聚物和低聚物存在；如降解時間過長，則降解成酚酸等小分子物質。

培養液中兒茶素的質量濃度隨時間的變化情況如圖3所示。由圖3可見，在初始培養階段，青霉和米曲霉培養液中兒茶素的質量濃度為負值，這是因為在初始階段，青霉和米曲霉菌株主要降解葡萄皮單寧栲膠中的非單寧類物質和單寧中低分子量的黃烷醇單體，導致培養液中兒茶素的消耗量大于生成量。隨培養時間的延長，微生物開始降解單寧多聚體，兒茶素的生成量大于消耗量，兒茶素質量濃度開始增加。此外，兒茶素質量濃度在青霉和米曲霉培養液中增長情況不同。青霉培養液中兒茶素質量濃度增長迅速，在24 h時青霉培養液中兒茶素質量濃度達到最大值0.30 mg/mL，此時兒茶素轉化率為51.7%。米曲霉培養液中兒茶素質量濃度在36 h時達到最大值0.16 mg/mL，此時兒茶素轉化率為32.2%。這反映出青霉和米曲霉對葡萄皮單寧降解能力及它們對降解中間產物反饋抵制作用的適應能力不同，青霉菌株的適應能力強于米曲霉菌株。隨降解時間進一步延長，葡萄皮栲膠中單寧逐漸減少，同時部分兒茶素進一步降解為芳香族酸類和酚類等小分子物質，因此培養液中兒茶素質量濃度逐漸降低。

圖3 培養時間對兒茶素質量濃度的影響Fig.3 Effect of incubation time on catechin mass concentration

2.3 溫度和pH對菌株降解單寧的影響

培養溫度和培養基初始pH會影響微生物菌株對營養物質的吸收以及代謝反應中生物酶的活性，從而對培養過程中底物降解和產物生成產生影響。選取青霉和米曲霉培養液中兒茶素的質量濃度達到最大值的培養時間(青霉培養24 h，米曲霉培養36 h)，比較在此培養時間條件下不同溫度和初始pH對青霉和米曲霉降解葡萄皮單寧影響(圖4和5)。結果表明，培養溫度和培養基初始pH 對青霉和米曲霉降解葡萄皮單寧具有較大影響。由圖4可以看出，當溫度較低或較高時，不利于青霉和米曲霉菌株生長，酶的活性較低，培養基中兒茶素的生成量低。青霉和米曲霉較適宜的培養溫度為28℃，此時兒茶素質量濃度達到最大值。其中，青霉培養基中兒茶素質量濃度為0.28 mg/mL，兒茶素轉化率為47.4%；米曲霉培養基中兒茶素質量濃度為0.14 mg/mL，兒茶素轉化率為30.4%。由圖5可以看出，pH偏低或偏高均不利于青霉和米曲霉對葡萄皮單寧的降解。青霉菌株在pH為6.0～6.5時，兒茶素質量濃度較高，pH為6.5時達到最大值，為0.27 mg/mL，兒茶素轉化率為46.0%。米曲霉菌株在pH為6.5～7.0時，兒茶素質量濃度較高，pH為6.5時達到最大值，為0.13 mg/mL，兒茶素轉化率為30.8%。

圖4 培養溫度對兒茶素質量濃度的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on catechin mass concentration

圖5 培養pH對兒茶素質量濃度的影響Fig.5 Effect of incubation pH on catechin mass concentration

2.4 單寧質量濃度對菌株降解單寧的影響

誘導培養基中葡萄皮單寧的質量濃度對兒茶素生成量和轉化率具有一定影響。選取青霉和米曲霉培養液中兒茶素的質量濃度達到最大值的培養時間(青霉培養24 h，米曲霉培養36 h)，比較在此培養時間條件下不同質量濃度的葡萄皮單寧對青霉和米曲霉降解單寧的影響(圖6)。由圖6可以看出，當培養基中葡萄皮單寧質量濃度較低時，兒茶素生成量隨單寧質量濃度的增加而升高，當添加的葡萄皮單寧達到一定質量濃度后，兒茶素生成量隨單寧質量濃度增加而下降。這是因為培養液中單寧質量濃度較高時，青霉和米曲霉的生長代謝會受到抑制作用，從而影響菌株的活性和降解能力。在青霉培養基中，葡萄皮單寧質量濃度為12.5 mg/mL時，兒茶素的質量濃度達到最大值0.32 mg/mL，此時兒茶素轉化率為52.3%。在米曲霉培養基中，葡萄皮單寧質量濃度為10.0 mg/mL時，兒茶素質量濃度達到最大值0.12 mg/mL，此時兒茶素轉化率為29.6%。

圖6 葡萄皮單寧質量濃度對兒茶素質量濃度的影響Fig.6 Effect of grape pomace tannins mass concentration on catechin mass concentration

3 結 論

選擇青霉和米曲霉為微生物菌株對葡萄皮單寧進行生物降解，研究不同降解工藝參數對降解效果的影響。研究結果表明：

1)外加碳源和氮源有利于青霉和米曲霉菌株的生長，較合適的碳源和氮源分別為蔗糖和硝酸鈉。

2)培養時間是葡萄皮單寧降解得到不同中間產物的關鍵參數。在青霉培養液中兒茶素質量濃度在24 h時達到最大值0.30 mg/mL，此時兒茶素轉化率為51.7%。在米曲霉培養液中兒茶素質量濃度在36 h時達到最大值0.16 mg/mL，此時兒茶素轉化率為32.2%。

3)溫度、pH和葡萄皮單寧質量濃度對青霉和米曲霉菌株活性和單寧降解能力均有不同程度影響。較適宜的培養溫度為28℃，pH為6.5，青霉培養基中葡萄皮單寧質量濃度為12.5 mg/mL，米曲霉培養基中葡萄皮單寧質量濃度為10.0 mg/mL，此時青霉和米曲霉培養液中兒茶素生成量達到最大值。

在合適的降解條件下，可采用生物降解法將葡萄皮單寧中的多聚體降解成低聚體和單體，從而降低葡萄皮單寧的分子量和聚合度。但筆者僅對生物降解的工藝參數進行了優化，并未對生物降解過程中葡萄皮單寧的化學組成與結構變化進行研究。在今后的研究工作中，將借助一些分析技術研究生物降解過程中單寧的化學組成與結構變化情況，分析葡萄皮單寧的生物降解途徑。

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Microbial degradation of grape pomace tannins

LAN Ping1,MA Zeyu1,YE Liuqing1,BROSSE Nicolas2,CHRUSCIEL Laurent2

(1.College of Materials Science and Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China; 2.Faculté des Sciences et Techniques,Université de Lorraine,Nancy 54500,France)

In this paper,Penicilliumsp.andAspergillusoryzaewere selected as biological strains to degrade grape pomace tannins to reduce its molecular weight and polymerization.The conversion and yield of catechin were chosen as index.The effects of carbon source,nitrogen source,culture time,culture temperature,pH and mass concentration of the tannins on the degradation of the tannins were studied.The results show that adding carbon and nitrogen sources is beneficial to the growth of microorganism strains.The incubation time is a key parameter influencing the intermediate degradation products of the condensed tannins.The incubation temperature,pH and mass concentration of the tannins have different effects on the activity and degradation ability of the strains.The degradation ability ofP.sp.strain is better thanA.oryzaestrain.The optimal degradation condition ofP.sp.strains is that the mass concentration of the tannins in induced medium is 12.5 g/L;the pH is 6.5;and the strains is cultured in shaking table at 28℃ for 24 h.The maximum mass concentration of the catechin is 0.32 mg/mL,and the maximum conversion is 52.3%.The optimal degradation condition ofA.oryzaestrains is that the mass concentration of the tannins in induced medium is 10.0 g/L;the pH is 6.5;and the strains is cultured in shaking table at 28℃ for 36 h.The maximum mass concentration of the catechin is 0.16 mg/mL,and the maximum conversion is 32.2%.It is possible to control the chemical composition of the grape pomace tannins and decrease its molecular weight and polymerization by microbial degradation method.

grape pomace tannins;catechin;P.sp.;A.oryzae;microbial degradation

TQ929

A

2096-1359(2017)05-0058-06

2017-01-19

2017-03-08

國家自然科學基金 (31400502，31470590，31500483)；2015年江蘇省雙創博士資助項目；南京林業大學大學生創新訓練計劃項目(2015SJCX011)。

蘭平,女,博士,研究方向為木質復合材料與木材膠黏劑。E-mail:nfu.lanping@163.com