高脂聯合LPS誘導小鼠胰島炎癥模型

姜宏衛，馬瑜瑾，王霖蕾，張穎裕，彭慧芳，鄭 偉

·基礎醫學·

高脂聯合LPS誘導小鼠胰島炎癥模型

姜宏衛，馬瑜瑾，王霖蕾，張穎裕，彭慧芳，鄭 偉

目的 探索飲食相關的胰島炎癥小鼠動物模型的構建方法。方法 用高脂喂養結合脂多糖（LPS）處理誘導小鼠胰島炎癥的發生，并用LiCl作為炎癥拮抗劑，通過不同方式及不同劑量LPS和LiCl篩選、糖耐量和組織形態結構的觀察來檢測不同誘導條件下小鼠胰島炎癥發生情況。結果 高脂飲食可以引起小鼠顯著的體質量升高，糖耐量發生變化，經300μg·kg-1·d-1皮下注射LPS連續6 d處理后，糖耐量并未發生進一步變化，但是胰島炎癥進一步加強，而6 d 120 mg·kg-1LiCl對所誘導的炎癥有一定的拮抗作用。結論 長期高脂喂養加上LPS處理能夠有效地用于小鼠胰島炎癥模型構建，LiCl可用于該模型炎癥阻斷。

糖耐受；高脂飲食；脂多糖；胰島炎癥

Abstract：Objective This study was designed to explore the diet-related modeling method of islet inflammation mouse models. Methods High-fat diet and lipopolysaccharides（LPS）treatments were used to induce pancreatic islet inflammation in mice，and LiCl was used as an antagonist for the inflammation.The treatment way and dosage of LPSand LiCl were detected.Glucose tolerance and morphological structure were employed to show the inflammation effects of different treatments in mice. Results High-fat diet could result in significant weight gain and glucose tolerance changes in mice.After 300μg·kg-1·d-1LPS subcutaneous injection for 6 days，the glucose tolerance did not change any more，but the islet inflammation was further strengthened.120 mg·kg-1of LiCl for 6 days had antagonistic effects on inflammation induced by high fat diet and LPS. Conclusion Long-term high-fat diet and LPS treatment can effectively be used in the islet inflammation model in mice，and LiCl can be used for blocking inflammation in this model.

Key words：glucose tolerance；high fat diet；lipopolysaccharide；pancreatic islet inflammation

肥胖及糖尿病等慢性代謝紊亂性疾病的發病人數正日益攀升，造成了重大的社會負擔，其中2型糖尿病中以慢性低度炎癥為特征的中心性肥胖及超重人數越來越多。2型糖尿病的慢性低度炎癥是由生活方式所誘導的，高脂飲食引起的代謝性內毒素血癥和慢性低度炎癥促進肥胖及糖尿病的發生發展［1］。許多報道指出，多數2型糖尿病人存在胰島炎癥，表現為胰島相關巨噬細胞數目升高，胰島素活性下降，淀粉樣蛋白堆積等［2-4］。因此構建動物胰島炎癥模型對肥胖及糖尿病相關的研究有重要意義。

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性菌菌壁的主要組成部分，可啟動炎癥，導致內毒素血癥。長期低劑量LPS所致的低度炎癥狀態，是肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和慢性炎癥性腸病等的發病機制之一［5-6］，并且攝入過度的脂肪同樣可啟動血液循環中 LPS的升高［7］，給予外源性 LPS及高脂飲食被廣泛用于誘導炎癥模型。

GSK-3β是NF-κB的重要調控因子，在調節機體炎癥與抗炎平衡中發揮重要作用［8］。LiCl是常用的GSK-3β抑制劑，可通過抑制肌醇單磷酸酶，使肌醇、IP3下降而誘導自噬，且不依賴于 mTOR途徑［9］，對炎性信號通路GSK3β的抑制可減輕炎癥反應。

本實驗對小鼠胰腺炎癥模型進行探索，選用高脂及高脂加LPS進行誘導，以及LiCl對誘導炎癥的阻斷作用，通過對干預方式及劑量的篩選，以及糖耐量等相關指標和形態結構的觀察，制備小鼠胰腺炎癥模型以及炎癥阻斷模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康7～8周齡 c57BL／6J雄性小鼠，體質量（21±2）g，購自北京華阜康公司，于河南科技大學第一附屬醫院新區醫院動物飼養中心飼養。SPF級飼養，溫度20～25℃，濕度40%～60%，12 h／12 h晝夜節律。籠具定期清洗消毒，每周更換一次墊料。實驗前所有小鼠適應性喂養1周，不限制攝食和飲水，動物實驗的過程遵循《中華人民共和國實驗動物管理條例》與倫理要求。

1.2 高脂誘導 隨機分配小鼠為兩組，對照組10只，標準飼料喂養7周；高脂組30只，高脂飼料喂養7周。不限飲水，其他飼養條件正常。標準飼料成分：脂肪10%，蛋白質20%，碳水化合物70%；高脂飼料成分：脂肪 60%，蛋白質 20%，碳水化合物20%［10-11］。每周對小鼠體質量及飼料進行稱重，評估平均每日攝食量及體質量變化。

1.3 小鼠胰島炎癥模型

1.3.1 LPS干預方式及劑量實驗 LPS干預方式選擇微量泵、皮下注射、腹腔注射3種方式：微量泵選擇300μg·kg-1·d-1持續給藥；皮下注射劑量分別為：300、600（300μg·kg-1·d-1×2次）、900（300μg·kg-1·d-1×3次）μg·kg-1·d-1；腹腔注射劑量分別為：100、150、300、600（300μg·kg-1·d-1×2次）、900（300μg·kg-1·d-1×3次）μg·kg-1·d-1。每種給藥方式及給藥劑量各處理6只小鼠。

1.3.2 LiCl干預劑量 LiCl選擇腹腔給藥，劑量分別為：預實驗分別選取 50、100、120、180、240 mg·kg-1·d-1，干預 6 d。每個給藥劑量各處理 6只小鼠。

1.3.3 實驗動物干預 將2.2中處理結束的小鼠重新分組，如下：原對照組為A組，仍為對照組，注射等計量的生理鹽水為對照；原高脂飼養組隨機分為B、C、D 3組，每組 10只，其中 B組：高脂組，高脂飼料喂養，不限飲水，注射等計量的生理鹽水；C組：LPS組，高脂飼料喂養 +LPS處理（第8～11周）；D組：LiCl組，高脂飼料喂養 +LPS處理（第8～11周）+LiCl處理（第11周）。

1.4 糖耐量檢測 于實驗第7周末和11周末進行糖耐量實驗。試驗前，各組小鼠更換墊料并禁食12 h，按1.0 g·kg-1劑量腹腔注射葡萄糖，分別測量注射后 0、15、30、60、120 min時小鼠血糖，用羅氏血糖儀及配套試紙檢測5個時間點尾靜脈血糖。

1.5 組織切片 給藥處理結束后，脫頸法處死小鼠，取胰腺組織置于4%甲醛中固定24 h，放入包蠟盒內進行梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片機以4μm厚度切片，切片完成后將玻片置于烤片機中30 min（溫度68℃），室溫保存。HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 統計方法 本實驗所有數據使用統計軟件SPSS 19.0處理，采用重復測量方差分析，以及協方差分析，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 高脂對小鼠體質量及胰島功能的影響 處理過程中，小鼠生長狀態較好，進食飲水正常，精神無明顯異常。高脂飲食（B組）小鼠體質量增加較快，在第3周時，平均體質量為27.39 g，高于對照組（A組）小鼠的平均值 23.61 g（P＜0.05）；第 7周時，B組小鼠平均體質量32.82 g，而 A組平均值為25.56 g，兩組比較有統計學差異（P＜0.05），結果如圖1所示。第7周飼養結束，對兩組小鼠進行糖耐量實驗，結果如圖2所示，糖負荷后15 min，兩組小鼠血糖均達高峰，15～30 min血糖水平開始下降，30 min時高脂組血糖顯著高于對照組（P＜0.05），計算曲線下面積（area under curve，AUC），高脂組顯著高于對照組（P＜0.05），表明高脂可導致小鼠糖耐量出現受損現象。

2.2 LPS干預方式和劑量 不同干預方式及劑量LPS處理下各組小鼠的情況如表1所列，微量泵和皮下注射方式干預的小鼠精神狀態均良好，未出現反應遲鈍等現象。但微量泵持續給藥植入口已發生開裂，造成微量泵脫落，對給藥有一定的影響和不便。3個濃度的皮下注射均未對小鼠精神狀態有明顯不利影響，但高劑量的皮下給藥需多次注射，容易造成實驗小鼠皮膚破潰、結痂等明顯損傷。各劑量的腹腔給藥均引發小鼠精神狀態差，且與劑量正相關，較低劑量引起進食量減少，高劑量則引發明顯反應遲鈍和處理后死亡現象。綜合以上結果，為避免LPS對實驗小鼠引起顯著精神負影響以及明顯傷口，應選擇的LPS給藥劑量和給藥方式為300μg·kg-1·d-1皮下注射，給予4周處理。

圖1 高脂飲食誘導7周后小鼠體質量的變化

圖2 高脂飲食誘導7周后小鼠葡萄糖耐量（A）及其曲線下面積（B）比較

表1 LPS干預后小鼠情況

（續表）

2.3 LiCl濃度 5個 LiCl處理濃度，50～240 mg·kg-1，均對小鼠精神狀態無明顯影響，如表2所示，但高濃度處理會引起不同處理時間小鼠脫毛現象，故LiCl處理濃度應不高于120 mg·kg-1，本實驗選用腹腔注射每天每次120 mg·kg-1，處理6 d。

表2 LiCl不同劑量干預后小鼠情況

2.4 LPS和LiCl處理對小鼠的作用 LPS給藥第1周，C、D組小鼠進食量、活動有所減少，對外界刺激稍顯遲鈍；對照組及單純高脂組（A、B組）小鼠無明顯改變。處理結束后對各組小鼠進行糖耐量實驗，如圖3A所示，與對照組（A組）相比，高脂組（B組）和 LPS組（C組）空腹血糖顯著升高（P＜0.05），LiCl組（D組）空腹及120 min時的血糖與A組無統計學差異（P＞0.05），在 15 min、30 min、60 min時間點，B、C、D組血糖與A組相比均有統計學差異（P＜0.05）；計算 AUC值顯示（圖 3B），B、C、D組與 A組相比均顯著升高，且LiCl組糖負荷60 min時血糖值以及AUC值與 LPS組相比均顯著降低（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠胰島組織形態變化 本實驗通過HE染色觀察各組小鼠胰島的形態學改變，結果如圖4所示，光鏡下，A組小鼠胰腺內分泌部的胰島與外分泌部的腺泡清晰可見，胰島呈團狀，胰島之間排列緊密，細胞呈圓形；B組胰島內偶見脂滴空泡，腺泡結構稍松散，可見散在單個炎細胞浸潤；C組腺泡失去正常組織結構，小葉缺失、間隙增大，部分腺泡呈孤島狀，炎性細胞浸潤，島內細胞未見明顯炎細胞浸潤；D組腺泡未見明顯孤島結構，偶見炎細胞浸潤。

圖3 第11周末小鼠葡萄糖耐量試驗結果

圖4 各組小鼠胰島形態變化（HE，×400）

3 討論

3.1 高脂引起糖耐量變化 高脂為肥胖、胰島素抵抗的“導火線”，高脂構建動物模型喂養周期較長，但能夠更好模擬胰島素抵抗的發生過程，操作簡便，被多數研究者選用［12］。另外高脂喂養可導致動物血液中內源性LPS水平升高［7］。本實驗用高脂喂養小鼠7周后進行IPGTT實驗，對小鼠胰島功能進行評估，結果表明高脂喂養確實會對小鼠糖耐量有顯著影響，這可能是由于長期高脂誘導所導致胰島β細胞功能受損。

3.2 LPS誘導炎癥 LPS作為菌壁成分之一，被廣泛用于誘導炎癥反應。用微量泵持續皮下泵入LPS（300 μg·kg-1·d-1），連續 4周，可導致代謝性內毒素血癥，引起炎性因子的表達［12］。LPS給藥方式及劑量不同，制備的炎癥模型亦不同。常見的給藥方式有腹腔給藥、皮下給藥、灌胃及靜脈注射給藥；腹腔注射通過腸系膜靜脈系統吸收，因吸收面積大、速度快，常用于急性模型；皮下給藥通過微血管、淋巴管吸收入血，因皮下血管少，吸收速度慢，可用于制備慢性模型；灌胃給藥產生的首過效應，影響入血藥量；靜脈給藥，包括頸靜脈及尾靜脈注射，藥物直接入血，可用于急性模型制備。文獻報道，單次注射給藥構建的急性炎癥大鼠模型中，尾靜脈給藥分別采用了 5、7.5、10、20 mg·kg-1，腹腔給藥劑量從 1～10 mg·kg-1不等［13-17］。慢性炎癥模型的誘導，部分研究者采用5 mg·kg-1或10 mg·kg-1劑量單次腹腔給藥，處理時間為 1、3、10個月［18-19］；部分用 0.25 mg·kg-1，每周兩次腹腔給藥，持續 12周［20］；Kitazawa M等用 LPS 0.5 mg·kg-1腹腔注射，2周1次，持續6周［21］。本實驗中腹腔注射后小鼠耐受差，給藥后小鼠進食量明顯減少、精神差、對外界刺激反應遲鈍，且腹腔多次給藥，會引起小鼠死亡的發生（見表1），不適合慢性模型的制備。而皮下植入微量泵300μg·kg-1·d-1，時間過長則易發生因傷口張力大而造成的傷口開裂，調整縫合方式后傷口裂開間期延長，但傷口紅腫，可能影響實驗相關炎性指標。一天多次皮下注射易導致皮膚破潰、結痂，影響藥物吸收。每天單次皮下注射（300μg·kg-1·d-1）組各小鼠耐受性好，在干預期間未出現死亡現象，故本實驗選取 LPS皮下給藥，劑量為300 μg·kg-1·d-1，持續 4周。

3.3 LiCl阻斷 作為GSK3β的抑制劑，LiCl被應用于相關研究中，LiCl腹腔給藥，其他給藥方式少有報道，故本實驗選用腹腔給藥方式，劑量為50～240 mg·kg-1之間，結果顯示，高劑量（240 mg·kg-1、180 mg·kg-1）會引起小鼠不同程度的脫毛現象，相對低劑量則無明顯不良影響，綜合考慮，本實驗推薦使用120 mg·kg-1劑量腹腔注射，干預期為6 d。

3.4 炎癥模型 在肥胖和糖尿病人群高脂飲食情況下，游離脂肪酸和神經酰胺水平升高，作用于NLRP3炎癥復合體，刺激炎性因子的釋放，導致全身系統性炎癥反應［22］。用 LPS刺激胰島素瘤細胞可以使其分泌炎性因子 IL-1β，導致胰島細胞損傷［23］，高脂飲食4周誘導的系統性炎癥反應類似于低劑量LPS皮下輸注4周引起的代謝性內毒素血癥［24］。小鼠LPS干預6周聯合高脂3周，可影響炎癥水平，但未出現糖耐量異常及脂代謝改變［25］。本實驗結果與現有的報道相一致，LPS干預4周后，各時間點血糖明顯高于對照組（A組），但與高脂組（B組）相比無統計學差異；給予LiCl干預后，在糖負荷后60 min時血糖及糖耐量曲線下面積與LPS組相比均明顯下降，差異有統計學差異，這說明LPS并未顯著加重由高脂飲食誘導的糖耐量受損；LiCl干預后小鼠糖耐量有所改善，提示LiCl能拮抗高脂及LPS誘導產生的糖耐量受損，這可能是通過對胰島β細胞功能的保護而起作用的。結合組織切片結果，高脂誘導和高脂加LPS誘導均引起小鼠胰島一定程度的結構破壞，而LiCL處理組可以對這種破壞起到一定的拮抗保護作用。說明在高脂7周加300μg·kg-1·d-1皮下注射 LPS 4周誘導的小鼠胰島炎癥模型中，120 mg·kg-1LiCl連續6 d腹腔給藥干預便可起到拮抗作用。

在小鼠胰島炎癥模型誘導過程中，長期高脂飲食可以刺激相關炎癥反應的發生，LPS可以增加炎癥的效果，但是并不加重高脂飲食對機體糖耐量的影響，適合劑量的LiCl可以有效拮抗LPS對胰島細胞的炎癥作用。

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Pancreatic Islet Inflammation Mice Model Induced by High Fat and LPS

JIANG Hong-wei，MA Yu-jin，WANG Lin-lei，ZHANG Ying-yu，PENG Hui-fang，ZHENG Wei
（1.Department of Endocrinology，First Affiliated Hospital，and College of Clinical Medicine of Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China；2.Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

R587；R589.2

A

1672-688X（2017）03-0161-05

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.001

國家自然科學基金（U1404805）

2017-05-27

1.河南科技大學臨床醫學院，河南科技大學第一附屬醫院，

河南洛陽471003

2.河南科技大學醫學院，河南洛陽 471023

姜宏衛（1974—），男，河南范縣人，副主任醫師，從事內分

泌相關臨床及研究工作。