粉單竹竹青色素提取工藝及其成分分析

金 葉 李廣興 劉 義 駱蓮新 李明富

(1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧,530004；2.廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點實驗室，廣西南寧,530004)

·竹青色素提取·

粉單竹竹青色素提取工藝及其成分分析

金 葉 李廣興 劉 義 駱蓮新*李明富

(1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧,530004；2.廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點實驗室，廣西南寧,530004)

粉單竹竹青；色素；超聲波提取

木材是世界造紙工業最常用的原料，而我國木材資源十分緊缺，原料的供應成為制約造紙工業發展的關鍵問題之一[1]。我國竹資源豐富，素有“竹子王國”之稱，竹子是優質的造紙原料，但是竹子高得率漿具有漂白難、易返黃的特性，其高得率法制漿尚處于研究階段[2]。

圖1 葉綠素與類胡蘿卜素分子結構

竹青(竹子外表皮)，中醫上又稱竹茹，《中藥辭海》中記載，竹茹為禾本科剛竹屬、箣竹屬和牡竹屬中一些竹種的莖稈所刮下的外皮層或相鄰一層[3],綠色植物的顏色來自于葉綠素[4]，綠葉中色素的提取物主要是葉綠素、類胡蘿卜素以及一些無色的物質。其中葉綠素具有較強的抗氧化能力[5]，類胡蘿卜素也具有強大的抗氧化活性，且是一種很好的自由基清除劑[6-7]。在H2O2的漂白過程中,色素的存在會消耗一部分H2O2。大部分綠色植物主要含有葉綠素a和葉綠素b，其分子結構如圖1(a)所示，在分子結構中，一部分是含有四吡咯環構成的卟啉環骨架，一部分是一個很長的脂肪烴側鏈，稱為葉綠醇[8-9]。類胡蘿卜素分為胡蘿卜素和葉黃素，其分子結構如圖1(b)、圖1(c)所示，二者在結構上均由8個類異戊二烯單元演變而成，具有多個共軛雙鍵[10-12]。樓鼎鼎[13]采用超臨界CO2流體萃取技術從剛竹屬竹子莖稈的外皮層中提取“竹子三菇皂戒元”，該物質是一種標準化制劑由木栓酮、羽扇豆烯酮及其同系物為主的五環三菇類化合物組成(EZR2002)；Nishina A等人[14]從毛竹的莖皮中檢出了抗菌活性成分2，6-二甲氧基對苯醌。由此可知，竹青組分含有不飽和鍵的發色或助色基團，在高得率竹漿制備過程中，如果這些基團殘留在竹漿中，會對竹子高得率漿白度及白度穩定性造成不利影響[15]。前人研究表明，通過揉搓分絲可破壞竹子的表皮蠟質層能有效改善漂白效果，增加預浸、水洗人工剝離表皮色素量，可提高竹子化機漿白度2%～3%，并降低紙漿返黃程度[16]。筆者初步研究了粉單竹去除竹皮與未去除竹皮磺化化學機械漿(SCMP)，發現未去除竹皮SCMP返黃值(1.05)大于去除竹皮SCMP返黃值(0.66)，且在相同漂白條件下，去除竹皮SCMP白度的增加略大于未去除竹皮SCMP白度的增加。

本實驗主要研究粉單竹竹青色素提取工藝及其成分分析，為今后提高竹子高得率漿白度提供理論依據。

1 實 驗

1.1原料

從廣西林業科學研究院取得2～3年生的新鮮粉單竹。

1.2實驗儀器

FZ102微型植物試樣粉碎機,北京市永光明醫療儀器有限公司；PL-S80超聲波清洗儀,東莞康士潔超聲波科技有限公司；RE-52A旋轉蒸發器,上海亞榮生化儀器廠；Analytik Jena紫外可見分光光度計、Magnet System 500′54 Ascend核磁共振波譜儀、Tensor II傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克分析儀器公司。

1.3實驗方法

1.3.1原料的制備

將剛采伐的粉單竹洗凈、刮皮、風干，經植物粉碎機粉碎，然后將磨成粉的竹青過60目篩得竹青粉，密封避光冷藏備用。

1.3.2超聲波提取法

稱量竹青粉1 g于100 mL燒杯中，加入乙醇溶液。將浸潤的樣品放入頻率40 kHz、額定功率1500 W的超聲波清洗儀中進行超聲處理，得到竹青粗提液。

1.4竹青色素定性及定量檢測方法

將竹青粗提液用0.45 nm有機濾膜過濾，過濾液用乙醇稀釋9倍。在紫外可見光區(400～800 nm)測稀釋過濾液的紫外光譜圖，并選擇合適吸收峰波長作為定性檢測。讀取645、663 nm波長吸光度，按Arnon公式[17]計算葉綠素a和葉綠素b含量以及提取的葉綠素總含量。

Ma=(12.71A663-2.59A645)·9V/(1000W)

(1)

Mb=(22.88A645-4.67A663)·9V/(1000W)

(2)

Mc=Ma+Mb

(3)

式中，Ma為葉綠素a的含量，mg/g；Mb為葉綠素b的含量，mg/g；Mc為葉綠素總含量；mg/g；V為提取液的體積，mL；W為竹青粉質量，g；A645為645 nm處的吸光度。A663為663 nm處的吸光度。

1.5竹青粗提液的柱層析分離

竹青色素純化：取5 g竹青粉，按照最佳提取方法提取竹青色素，旋轉蒸發提取液到20 mL，用10 mL石油醚(30～60℃)萃取，取上層液，然后用蒸餾水洗滌上層液兩次，放置備用。

柱層析分離：層析柱的固定相為中性氧化鋁(100～200目)，用石油醚平衡，洗脫劑依次為石油醚-丙酮(10∶1)、石油醚-丙酮(5∶2)、石油醚-丙酮(5∶3)、甲醇階梯洗脫，收集分離的色素，然后在400～800 nm處測紫外光光譜圖。

1.6核磁譜圖的分析

將竹青粗提液純化后的竹青色素旋轉蒸發通氮氣干燥，然后溶解在氘代氯仿(CDCl3)中，在500 MHz的頻率下測其1H-NMR譜圖。

1.7紅外光譜分析

將竹青粗提液純化后的色素旋轉蒸發通氮氣干燥，與KBr混合壓片進行紅外光譜測定。

2 結果與討論

2.1超聲波提取單因素實驗結果

葉綠素a和葉綠素b在紅光區最大吸收峰分別為663、645 nm附近，在藍光區最大吸收峰為453、429 nm附近[18]。藍光區易受類胡蘿卜素的干擾。竹青粗提液在400～800 nm的紫外可見光吸光光譜圖如圖2所示，該圖與芒果樹葉葉綠素粗提液吸收光譜圖相似[19],在666 nm處有明顯的吸收峰。故本實驗選擇666 nm作為竹青色素的定性檢測紅外波長。

圖2 竹青粗提液紫外可見吸收光譜

2.1.1乙醇濃度

葉綠素是一種酯，易溶于有機溶劑，由于丙酮、乙醚有毒，且價格相對較高，所以本實驗選擇乙醇為提取劑。在料液比1∶30、超聲時間60 min、超聲溫度55℃的條件下，研究乙醇濃度對葉綠素含量和吸光度的影響，結果見圖3。由圖3可知，當乙醇濃度由60%增加到90%(體積分數)時，葉綠素含量和吸光度不斷增加；當乙醇濃度超過90%時，吸光度減小，這可能是由于葉綠素a與葉綠素b結構中均有一個極性的“頭部”，所以用含有一定水量的有機溶劑來提取葉綠素效果更好，故乙醇提取的最佳濃度為90%。

圖3 乙醇濃度對葉綠素含量和吸光度的影響

2.1.2超聲溫度

在乙醇濃度90%、料液比1∶30、超聲時間60 min的條件下，研究超聲溫度對葉綠素含量和吸光度的影響，結果見圖4。由圖4可知，當超聲溫度由35℃升高到55℃時，葉綠素含量逐漸增加，當溫度超過55℃時，葉綠素含量下降，這是因為葉綠素不穩定，溫度過高可能使葉綠素結構發生改變或竹青粉內雜質溶出，不利于葉綠素的提取，所以超聲溫度最佳為55℃。

2.1.3超聲時間

在乙醇濃度90%、超聲溫度55℃、料液比1∶30的條件下，超聲時間對葉綠素含量和吸光度的影響結果見圖5。由圖5可知,當超聲時間由20 min延長到40 min時，葉綠素含量不斷增加，超聲時間超過40 min后隨著超聲時間的增加，葉綠素含量逐漸減小，其原因可能是過長的超聲時間導致其他雜質的溶出從而導致葉綠素含量下降。超聲持續的機械振動與空化作用導致葉綠素的分子結構受到破壞也會導致吸光度降低，所以超聲時間應選擇40 min。

圖5 超聲時間對葉綠素含量和吸光度的影響

2.1.4料液比

料液比是提取過程的一個重要影響因素，在乙醇濃度90%、超聲溫度55℃、超聲時間60 min的條件下，料液比對葉綠素含量和吸光度的影響見圖6。由圖6可知，在料液比1∶20～1∶35范圍內，隨著提取液的增加，葉綠素含量不斷增加，當超過1∶35時，葉綠素含量反而減小。從傳質速率的角度看：主要表現在影響固相主體和液相主體之間的濃度差，即傳質推動力。料液比大，提取過程中液相濃度增加快，兩相間的濃度差減少加快，從而使傳質推動力衰減加快，影響傳質速率。料液比的減小必然會在較大的程度上提高傳質推動力，但是過低的料液比可能會導致雜質析出，影響葉綠素的提取，同時考慮到成本以及提取液的回收，較佳的料液比為1∶35。

圖6 料液比對葉綠素含量和吸光度的影響

從圖3～圖6可知，竹青色素定性測量的變化趨勢與Arnon公式計算葉綠素含量的變化趨勢相一致。

2.1.5提取次數

在乙醇濃度90%、超聲時間40 min、超聲溫度55℃、料液比1∶35的最佳工藝條件下，依次提取竹青葉綠素四次，每提取一次，使用紫外光譜儀檢測一次，并根據Arnon公式計算葉綠素含量，計算結果見表1。由表1可知，經過兩次提取，竹青葉綠素已基本提取完全，從經濟的角度考慮，竹青葉綠素可以提取兩次,提取率約為0.39%。

2.2紫外光譜分析

通過石油醚萃取，下層液含有許多雜質，將上層液通過柱層析分離，依次得到橙黃色、藍綠色、黃色和綠色4種色素，這4種色素分別在可見光區測紫外光譜圖，結果如圖7～圖9所示。

表1 提取次數對葉綠素含量影響

注A666是波長666 nm處的吸光度。

圖7 橙黃色色素紫外光譜圖

圖8 藍綠色和綠色色素紫外光譜圖

圖9 黃色色素紫外光譜圖

葉綠素a和葉綠素b及其衍生物對紅光區(620～700 nm)和藍紫光區(400～500 nm)的光吸收特別強烈,而對綠光區(520～580 nm)的光則吸收較弱,因而葉綠素呈現綠色[20]。由圖8可知，藍綠色色素和綠色色素分別在藍光區410 nm、437 nm處有最大吸收峰，在紅光區667 nm、665 nm處有最大吸收峰，并且與相關文獻[21-24]的葉綠素a、葉綠素b的紫外光譜圖相似，類胡蘿卜素由于分子結構中具有共軛雙鍵這個獨特的發色基團，所以在紫外藍光區(400～500 nm)有特征吸收峰，能呈現出紅、橙、黃色[7]，圖7和圖9分別在447 nm、449 nm處出有最大吸收峰，并且與相關文獻[9，24]的類胡蘿卜素的紫外光譜相似。通過以上分析可判斷提取的色素分別是葉綠素和類胡蘿卜素。

圖11 竹青粗提液純化后的紅外光譜圖

2.3核磁譜圖分析

據有關文獻可知[12,25-27]，δ為7.26處為CDCl3溶劑峰，δ大于11.7處是雜峰，δ為11.2～8.5處為四吡咯環上的H,主要來源于葉綠素及其衍生物上的次甲基質子，由于葉綠素b上含有醛基，所以峰位在前段,δ為8.0～7.0處存在芳香族上的H，δ為7.0～5.4處為類胡蘿卜素萜烯的鏈以及與其他有著共軛雙鍵峰(葉綠素及其衍生物上的共軛雙鍵)重疊峰的區域，δ為5.4～5.0之間可能存在著脂肪酸上雙鍵質子，δ為5.0～3.0處是氧原子上的飽和氫，可能是甾醇、甘油樹脂等產生的，而δ為2.4～0.8是脂肪族上的飽和氫，δ為-1.5～-2.0是葉綠素卟啉類化合物上的N—H鍵上的H引起的。由圖10可知，竹青色素純化液中除了色素可能還含有其他物質，如脂肪酸、甾醇等。

圖10 竹青粗提液純化后的核磁譜圖

2.4紅外光譜分析

3 結 論

3.1以乙醇為提取劑，超聲波提取法提取粉單竹竹青色素，得出最佳提取條件為：乙醇濃度90%，料液比1∶35，超聲時間40 min, 超聲溫度55℃；從經濟的角度考慮，竹青葉綠素可以提取兩次，提取率為0.39%。

3.2竹青提取液經石油醚萃取純化后通過柱層析分離色素得到橙黃色、藍綠色、黃色、綠色4種色素，通過測4種色素紫外光譜圖，可知所測光譜圖與葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素圖相似。

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(責任編輯：董鳳霞)

ExtractionTechnologyandCompositionAnalysisofBambooBarkPigmentfromBambusaChungii

JIN Ye LI Guang-xing LIU Yi LUO Lian-xin*LI Ming-fu

(1.CollegeofLightIndustryandFoodEngineering,GuangxiUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion, 530004; 2.GuangxiKeyLabofCleanPulpingandPapermakingandPollutionControl,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion， 530004)

BambusaChungii bamboo bark; pigment; ultrasonic extraction

金 葉女士，在讀碩士研究生；主要研究方向：清潔化制漿造紙新技術與污染控制。

TS721+.2

A

10.11980/j.issn.0254- 508X.2017.09.005

2017- 08- 02(修改稿)

國家自然科學基金項目“高得率竹漿中非木素組分的光熱誘導返色機理和生物調控”(項目批準號：31660182)。

*通信作者：駱蓮新，副教授；研究方向：清潔化制漿造紙新技術與污染控制。

(*E-mail: lxluo919@163.com)