固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法測定原料乳中的苯甲酸

舒平，趙浩軍，徐幸

(大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南大理 671000)

固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法測定原料乳中的苯甲酸

舒平，趙浩軍，徐幸

(大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南大理 671000)

以固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（SPME-GC/MS），分析測定原料乳中苯甲酸。采用75 μm carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）萃取纖維，以1,2-二氯苯作為內(nèi)標(biāo)，對苯甲酸進(jìn)行定量。結(jié)果表明，苯甲酸在檢測范圍0.5～20 mg/L內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系（R2=0.9913）。原料乳中苯甲酸的檢出限和定量限分別為0.2 mg/L和0.5 mg/L，平均回收率為83.2%～97.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為4.8%～9.3%。該方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠，適合用于原料乳中苯甲酸的確證分析。

苯甲酸；1,2-二氯苯；固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法（SPME-GC/MS）；原料乳

Abstract:A method for solid phase micro extraction and gas chromatography mass spectrometry(SPME-GC/MS)was developed for the de?termination of benzoic acid in raw milk.75 μm carboxen/polydimethylsiloxane(CAR/PDMS)fiber was selected for extraction in this study.1,2-dichlorobenzene was used as an internal standard for quantifying benzoic acid.The results showed that the linear relationships between ratio of peak area and concentration of benzoic acid(R2=0.9913)was good enough from 0.5 to 20 mg/L.The limits of detection(LOD)and limits of quantification(LOQ)for benzoic acid were 0.2 mg/L and 0.5 mg/L,respectively.The average recoveries was 83.2%～97.9%,and the relative standard deviations(RSDs)was 4.8%～9.3%.This method is convenient and reliable,and it is suitable for the determination of benzoic acid in raw milk.

Key words:Benzoic acid;1,2-dichlorobenzene;SPME-GC/MS;Raw milk

0 引言

苯甲酸（benzoic acid）能抑制微生物生長，是重要的防腐劑[1]。按國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，牛乳中不能使用苯甲酸用于防腐[2]。然而牛乳中天然存在少量的苯甲酸[3，4]，主要為馬尿酸或苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來[5-7]。當(dāng)牛乳變質(zhì)時，苯甲酸也會增加[8]，測定原料乳中苯甲酸不僅可以監(jiān)測添加防腐劑的情況，也可監(jiān)測牛乳是否新鮮。

目前測定苯甲酸的方法，主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、離子色譜法[11]、氣質(zhì)聯(lián)用法等[12]和液質(zhì)聯(lián)用法[13]。這些前處理方法需有機溶劑提取富集，步驟繁瑣且污染。固相微萃取技術(shù)（solid phase micro ex?traction，SPME），可頂空萃取目標(biāo)物[14]，操作簡便。本研究采用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用法，內(nèi)標(biāo)法定量，建立原料乳中苯甲酸的檢測方法。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890-240離子阱氣質(zhì)聯(lián)用儀，Combi PAL GC多功能自動進(jìn)樣器，75 μm carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）固相萃取纖維頭，苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（編號GBW(E)100006，質(zhì)量濃度為1 g/L），1，2-二氯苯（純度≥98.0%），苯甲酸鈉（分析純），無水乙醇（色譜純），濃硫酸（優(yōu)級純），測試的原料乳樣品是從當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶收購獲得。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)工作液：準(zhǔn)確稱取100 mg的1，2-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解并定容于100 mL的容量瓶中，搖勻備用，質(zhì)量濃度為1 g/L的1，2-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用無水乙醇稀釋成10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別吸取2.5，5，10，25，50 μL和100 μL的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于20 mL的頂空瓶中，再分別加入10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的1，2-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入超純水使溶液總體積為5 mL，分別配制成質(zhì)量濃度為0.5，1，2，5，10 mg/L和20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.2.2 樣品處理

準(zhǔn)確吸取5 mL牛乳樣品置于20 mL的頂空瓶中，加入10 μL濃度為10 mg/L的1，2-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)儲備液作為內(nèi)標(biāo)，加入200 μL濃度為1 mol/L的硫酸溶液酸化，渦旋混勻1 min。

1.2.3 氣質(zhì)聯(lián)用的分析條件

樣品預(yù)熱溫度為70℃，用75 μm CAR/PDMS纖維頭萃取吸附20 min，然后將萃取纖維頭插入溫度為240℃的進(jìn)樣口解吸5 min；不分流進(jìn)樣模式。以DB-1701毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）為分離色譜柱；色譜條件為：50℃保持5 min，以10℃/min的速率升溫至100℃，再以30℃/min的速率升溫至250℃，保持0.2 min；氦氣流速為1.2 mL/min；質(zhì)譜分析條件為：電子轟擊（EI）離子源；接口溫度為240℃；阱溫為100℃；離子源溫度180℃；以選擇離子存儲（SIS）模式掃描特征離子，參數(shù)如表1所示。

表1 目標(biāo)物的保留時間和特征離子

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

通過離子阱氣質(zhì)聯(lián)用儀全掃描模式，獲得了苯甲酸和1，2-二氯苯的質(zhì)譜圖，如圖1所示，由質(zhì)譜圖可以看出目標(biāo)物的特征離子，由此來選定目標(biāo)物的定量與定性離子，采用選擇離子存儲（SIS）模式對特征離子進(jìn)行掃描。

圖1 全掃描質(zhì)譜圖

通過離子阱氣質(zhì)聯(lián)用儀的SIS模式分析檢測苯甲酸和1，2-二氯苯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得了選擇離子掃描圖，如圖2所示。

圖2 苯甲酸和1,2-二氯苯標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子掃描結(jié)果

2.2 固相微萃取條件的選擇

苯甲酸分子含有苯環(huán)和羧基，羧基具有極性，因此選擇能吸附極性物質(zhì)的CAR/PDMS萃取纖維頭，且苯甲酸具有揮發(fā)性，可以用頂空法進(jìn)行萃取。本研究考察了不同溫度萃取苯甲酸的峰面積變化情況，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著萃取溫度的升高，苯甲酸的峰面積增大，在70℃時達(dá)到較高的響應(yīng)值，由于苯甲酸的峰面積在80℃時沒有明顯高于70℃時，故選擇了萃取溫度為70℃。

圖3 萃取溫度對苯甲酸萃取效果的影響

2.3 酸化條件的選擇

苯甲酸分子具有揮發(fā)性，在頂空時可以被萃取纖維頭吸附，而苯甲酸鈉不具有揮發(fā)性，難以被萃取纖維頭吸附，由于人為添加防腐劑時，可能會選擇添加苯甲酸鈉，因此，在測定樣品中的苯甲酸鈉，需要將其酸化為苯甲酸進(jìn)行測定。GB 5009.28-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中，采用鹽酸對苯甲酸鈉進(jìn)行酸化[15]，由于鹽酸具有揮發(fā)性，頂空萃取時，可能會將萃取纖維頭溶脹，故選擇不具有揮發(fā)性的硫酸來進(jìn)行酸化。本研究考察了不同體積濃度為1 mol/L的硫酸溶液對苯甲酸鈉的酸化效果，如圖4所示，添加100 μL以上的硫酸溶液，苯甲酸鈉轉(zhuǎn)化為苯甲酸的量達(dá)到相對平衡，由于酸化的目的是將樣品中的苯甲酸鈉盡可能地轉(zhuǎn)化為苯甲酸，添加硫酸需要過量，而同時又不能使樣品的總體積有太大的變化，因此，選擇添加200 μL濃度為1 mol/L的硫酸溶液進(jìn)行酸化。

圖4 硫酸對苯甲酸鈉酸化效果的影響

2.4 方法驗證

以苯甲酸對1，2-二氯苯的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，苯甲酸的濃度作為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明苯甲酸質(zhì)量濃度在0.5～20 mg/L時，回歸方程為Y=0.4952X+0.2173（R2=0.9913），線性關(guān)系良好。根據(jù)3倍和10倍信噪比（S/N）分別計算檢出限和定量限，在原料乳中檢出限和定量限分別為0.2 mg/L和0.5 mg/L，與GB 5009.28-2016 相比[15]，檢出限更低，靈敏度更高。

分別在原料乳樣品中添加苯甲酸三個濃度水平的回收率實驗，每份樣品重復(fù)測定6次，平均回收率的計算方法為：（平均實測值－本底值）/加標(biāo)質(zhì)量濃度×100%，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，苯甲酸的平均回收率為83.2%～97.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%～9.3%。

表2 苯甲酸在原料乳中的回收率和精密度實驗（n=6）

2.5 實際樣品的測定

按照本實驗所建立的方法對17份收購的原料乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示苯甲酸在原料乳中存不同程度的殘留，最高質(zhì)量濃度達(dá)到13.2 mg/L，最低質(zhì)量濃度為0.8 mg/L，含量小于1 mg/L的樣品為2個，質(zhì)量濃度在1～5 mg/L的樣品為11個，質(zhì)量濃度在5～10 mg/L的樣品為3個，質(zhì)量濃濃大于10 mg/L的樣品為1個，分析抽檢樣品的結(jié)果，絕大多數(shù)的苯甲酸質(zhì)量濃度都較低，基本排除人為在原料乳中添加苯甲酸及其鈉鹽的情況，而根據(jù)文獻(xiàn)報道，當(dāng)牛乳變質(zhì)，導(dǎo)致酸度升高時，苯甲酸質(zhì)量濃度可能會有所增加[8]。

3 結(jié) 論

采用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，以及添加1，2-二氯苯作為內(nèi)標(biāo)物，建立了原料乳中苯甲酸的檢測方法。此方法前處理方式簡單，無需采用有機溶劑提取，對環(huán)境和實驗人員都具有保護(hù)作用，且采用質(zhì)譜分析，對于目標(biāo)物的定性確證更加準(zhǔn)確，避免了誤判的情況。同時本文還對原料乳樣品進(jìn)行抽樣檢測，檢測結(jié)果可為今后的食品安全風(fēng)險監(jiān)測，以及原料乳中苯甲酸本底值的研究，提供參考依據(jù)。

[1]吳麗莉.發(fā)酵乳制品中苯甲酸的來源及水平[J].中國乳品工業(yè)，2007，35(3):43-46.

[2]GB 2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3]QI P，HONG H，LIANG X，et al.Assessment of Benzoic Acid Levels in Milk in China[J].Food Control，2009，20:414-418.

[4]李晰暉，任國譜.原料乳中苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制措施的研究進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè)，2013，41(1):32-35.

[5]SIEBER R，BIITIKOFER U BOSSET J O.Benzoic Acid as a Natu?ral Compound in Cultured Dairy Products and Cheese[J].Internation?al Dairy Journal，1995（5）:227-246.

[6]章慧，韓奕奕.飼料中苯甲酸鈉向生鮮乳的遷移水平及轉(zhuǎn)化規(guī)律[J].中國乳品工業(yè)，2016，44(6):24-27.

[7]謝國祥，吳麗莉，宋如森，等.乳制品中馬尿酸的檢測及其在發(fā)酵過程中動態(tài)變化研究[J].食品科學(xué)，2005，26(9):426-429.

[8]陳亞成，賈彩鳳，王疆元，等.牛乳中苯甲酸的HPLC測定及來源分析[J].食品工業(yè)科技，2010，31(6):94-99.

[9]張紅霞，盧克剛，梁秀清，等.氣相色譜法測定液體乳及乳粉中的7種防腐劑[J].中國乳品工業(yè)，2012，40(10):46-48.

[10]王克新，房玉國，張立宏，等.HPLC法測定乳制品中的苯甲酸和山梨酸含量[J].中國乳品工業(yè)，2006，34(4):54-55.

[11]WANG Z，XIA J，ZHAO F，et al.Determination of Benzoic Acid in Milk by Solid-Phase Extraction and Ion Chromatography with Con?ductivity Detection[J].Chinese Chemical Letters，2013，24:243-245.

[12]胡桂林，趙源，常建軍，等.氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中的苯甲酸，中國乳品工業(yè)，2010，38(6):56-59.

[13]FUSELLI F，GUARINO C，LA MANTIA A，et al.Multi-detection of Preservatives in Cheeses by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2012，906:9-18.

[14]BOYACI E，RODRIGUEZ-LAFUENTE A，GORYNSKI K，et al.Sample Preparation with Solid Phase Microextraction and Exhaustive Extraction Approaches:Comparison for Challenging Cases[J].Ana?lytica Chimica Acta，2015，873:14-30.

[15]GB 5009.28-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定[S].

Determination of benzoic acid in raw milk by SPME-GC/MS

SHU Ping，ZHAO Haojun，XU Xing
(Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision,Dali 671000,China)

TS252.7

A

1001-2230（2017）09-0057-03

2017-02-07

舒平（1975-），男，高級工程師，研究方向為食品質(zhì)量安全檢測。

徐幸