茉莉酸甲酯對甘草根次生代謝的調(diào)控

梁曉薇，楊 全，李 丹，程軒軒，唐曉敏，潘利明，張春榮

（廣東藥科大學中藥學院/國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006）

茉莉酸甲酯對甘草根次生代謝的調(diào)控

梁曉薇，楊 全，李 丹，程軒軒，唐曉敏，潘利明，張春榮

（廣東藥科大學中藥學院/國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006）

為探討茉莉酸甲酯（MeJA）對甘草根次生代謝的調(diào)控及其機制，分別用20、50、100 μmol/L的MeJA噴施甘草葉片，高效液相色譜法測定甘草根中甘草酸和甘草苷等有效成分含量，實時熒光定量PCR法分析甘草根次生代謝途徑重要酶β-香樹脂醇合酶（GubAS）、β-香樹脂醇-11-氧化酶（GubAO）、6-脫氧查爾酮合酶（GuDOCS）基因的相對表達水平。結果表明，20、50 μmol/L MeJA溶液處理的甘草酸含量得到極顯著提高，100 μmol/L MeJA溶液處理的甘草酸含量與對照無顯著差異；20、50 μmol/L MeJA溶液對甘草苷的積累沒有顯著影響，而100 μmol/L MeJA溶液處理的甘草苷含量降低。20 μmol/L MeJA溶液處理甘草0～6 h對GubAS、GuDOCS基因的表達均有促進作用，處理2～6 h對GubAO的表達也有促進作用；50 μmol/L MeJA溶液處理0～2 h對GubAS、GubAO、GuDOCS基因的表達水平都有提高作用，但隨著處理時間延長，3個基因表達均恢復處理前水平；100 μmol/L MeJA溶液對GubAS和GubAO表達均無顯著影響，GuDOCS表達量在100 μmol/L MeJA溶液處理2 h時得到提高，隨后逐漸下降，并在處理24 h后出現(xiàn)降低現(xiàn)象。推斷中低濃度MeJA在處理初期對甘草有效成分生物合成水平有上調(diào)的作用，隨著處理濃度提高與時間延長，MeJA的促進作用逐漸減弱，甚至出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

甘草；茉莉酸甲酯；基因表達；次生代謝

Abstract：To investigate the regulation mechanism of methyl jasmonate （MeJA） on secondary metabolism of Glycyrrhiza uralensis root，the G. uralensis seedlings were treated by 20，50，100 μmol/L MeJA. After 9 d，the contents of active ingredients in G. uralensis roots were detected by high performance liquid chromatography（HPLC）. And the expression patterns of key enzymes on biosynthetic pathway in G. uralensis roots treated by MeJA for 0，2，6，12，24，36，72 h were analyzed by real-time PCR. The results showed that the contents of glycyrrhizic acid in G. uralensis roots improved in both middle and low concentrations of MeJA，whereas the contents of liquiritin reduced in high concentrations of MeJA. The expression of GubAS，GubAO in G. uralensis roots were promoted by 20 and 50 μmol/L MeJA，and the expression of GuDOCS was promoted by 20 μmol/L MeJA. However，100 μmol/LMeJA suppressed GubAS and GuDOCS expression. All three genes expression reached the highest level at 6 h under the induction of 20 μmol/L MeJA. It can be concluded that MeJA in middle and low concentrations have the upregulation effect on biosynthesis of glycyrrhizic acid. However only low concentration can promote the biosynthesis of liquiritin.

Key words：Glycyrrhiza uralensis Fisch；methyl jasmonate；gene expression level；secondary metabolism

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科多年生草本植物，其根及根莖為常用中藥，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效［1］，被廣泛用于食品、化妝品等領域。市場對甘草的大量需求導致野生資源枯竭，同時人工栽培的商品甘草良莠不齊，有的甚至低于《中國藥典》要求［2］，如何提高栽培甘草的品質(zhì)成為目前甘草行業(yè)亟需解決的關鍵問題。

甘草有效成分主要是甘草苷為主的黃酮類化合物和甘草酸為主的三萜皂苷類化合物，二者也是《中國藥典》評價甘草品質(zhì)的主要指標［1］。甘草苷和甘草酸具有抗氧化［3］、抗病毒［4］、抗炎［5］等生物活性，是甘草適應生存環(huán)境的物質(zhì)基礎。甘草為陽生旱生植物，適度干旱脅迫能夠促進甘草根中甘草苷和甘草酸的積累［6-7］。我們對適度干旱脅迫下甘草根的轉(zhuǎn)錄組進行測序和分析發(fā)現(xiàn)，適度干旱脅迫能夠促進茉莉酸生物合成和信號轉(zhuǎn)導途徑關鍵因子的基因表達，暗示茉莉酸參與甘草的次生代謝和抗旱適應［8］。

茉莉酸及茉莉酸甲酯（methy jasmonate，MeJA）是參與植物抗逆特別是抗蟲脅迫的植物激素，外施到植物體可以調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的積累［9-10］。我們在前期研究基礎上研究不同濃度MeJA處理對甘草根有效成分甘草酸和甘草苷的積累，以及MeJA對甘草有效成分生物合成途徑關鍵酶β-香樹脂醇合酶（β-amyrin synthase，GubAS）［11］、β- 香樹脂醇 -11- 氧化酶（β-amyrin 11-oxidase，GubAO）［12］和 6-脫氧查爾酮合酶（6' -deoxychalcone synthase，GuDOCS）［13］基因表達的影響，探討MeJA對甘草根次生代謝的調(diào)控及其分子機制。研究結果有助于揭示甘草在干旱環(huán)境中通過茉莉酸調(diào)控有效成分積累的機制，同時為應用化學調(diào)控提高甘草品質(zhì)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘草種子采自內(nèi)蒙古杭錦旗4年生甘草，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學魏勝利老師鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的種子。種子萌發(fā)后，將幼苗移栽至營養(yǎng)土∶沙子∶土壤=2∶2∶1（體積比）的花盆中，按常規(guī)方法栽培。

茉莉酸甲酯（美國Sigma公司）；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根公司）；PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus，大連寶生物工程有限公司）；CFX96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 MeJA處理甘草 甘草栽培6個月后，用20、50、100 μmol/L的MeJA溶液噴施葉片，0、2、6、12、24、36、72 h后取部分甘草根快速洗凈后用液氮速凍，-80℃保存，用于基因表達水平測定。剩余甘草每3 d噴施一次MeJA溶液，連續(xù)處理3次，藥后9 d取根和根莖陰干，用于甘草根有效成分含量測定。每個處理3次重復。

1.2.2 甘草酸和甘草苷含量測定 取甘草干燥樣品，粉碎后過三號篩，精密稱定0.2 g加入100 mL 70 %乙醇，稱定重量，超聲提取30 min后補足重量，過濾取濾液作為供試品溶液。參照《中國藥典》采用高效液相色譜法測定甘草酸和甘草苷含量［1］。

1.2.3 基因表達量測定 （1）甘草根總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 將MeJA溶液處理0、2、6、12、24、36、72 h的甘草根使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒，參照說明書的方法進行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA。

（2）實時熒光定量PCR（qPCR） 根據(jù)本課題組甘草根轉(zhuǎn)錄組測序得到的GubAS、GubAO、GuDOCS基因序列［10］設計引物（表1）。采用 SYBR Premix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）試劑盒和CFX96熒光定量PCR儀進行qPCR。PCR 擴增程序：95℃，30 s；95℃，5s；58℃，30 s；39個循環(huán)。以管家基因β-Tubulin的表達量作參照，采用2﹣△△Ct法計算基因相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 MeJA對甘草根中甘草酸和甘草苷積累的調(diào)控

由圖1可知，MeJA溶液處理甘草根對其有效成分甘草酸含量有顯著效果，特別是濃度為20、50 μmol/L MeJA溶液處理的甘草酸濃度與對照相比有極顯著提高。20 μmol/L MeJA溶液對甘草苷的含量沒有顯著影響，高濃度MeJA溶液處理下甘草苷含量顯著降低。

圖1 MeJA濃度對甘草根有效成分積累的影響

2.2 MeJA對甘草根次生代謝關鍵酶基因表達水平的調(diào)控

2.2.1 熒光定量PCR標準曲線的建立 圖2為目的基因GubAS、GubAO、GuDOCS和內(nèi)參基因β-Tubulin標準曲線，其中擴增效率與相關系數(shù)見表2。在檢測樣品5個濃度梯度中，擴增效率結果表明內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率都在90%～105%范圍。相關系數(shù)大于0.98表明Ct值與起始模板稀釋倍數(shù)的相關性良好，目的基因和內(nèi)參基因擴增效率符合2-△△Ct法計算相對表達量的條件。

表2 目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率和相關系數(shù)

2.2.2 甘草根次生代謝關鍵酶基因表達水平 從GubAS基因表達量的變化（圖3 A）可知，20 μmol/L MeJA溶液處理0～6 h與50 μmol/L MeJA溶液處理0～2 h均對甘草根GubAS基因表達有不同程度的促進作用，其中20 μmol/L MeJA溶液處理6 h的甘草中，GubAS基因表達量與起始表達量相比有極顯著提高，且隨處理時間的延長，中低濃度的MeJA處理組中GubAS基因表達逐漸恢復處理前水平；100 μmol/L MeJA溶液對GubAS基因表達沒有顯著作用。

對于GubAO基因（圖3B），20 μmol/L MeJA溶液處理0～6 h與50 μmol/L MeJA溶液處理0～2 h均促進其表達，在20 μmol/L MeJA溶液處理6 h的甘草根中GubAO基因表達量得到極顯著提高，隨后逐漸恢復至處理前水平；100 μmol/L MeJA溶液處理下GubAO基因與起始表達量相比無顯著性差異。

圖2 目的基因GubAS（A）、GubAO（B）、GuDOCS（C）與內(nèi)參基因β-Tubulin（D）的qPCR標準曲線

圖3 MeJA處理濃度和時間對甘草根GubAS（A）、GubAO（B）、GuDOCS（C）基因表達的調(diào)控

由圖3C可知，20 μmol/L的MeJA溶液處理0～6 h促進GuDOCS基因表達，其中20 μmol/L MeJA溶液誘導6 h的GuDOCS基因表達量得到極顯著提高；50 μmol/L MeJA溶液處理對GuDOCS基因表達沒有明顯的促進作用，100 μmol/L MeJA溶液處理2 h后促進甘草根中GuDOCS基因表達，24 h后出現(xiàn)抑制GuDOCS基因表達的現(xiàn)象。

3 結論與討論

已有研究表明，施用MeJA等植物生長調(diào)節(jié)劑能有效提高栽培藥用植物的品質(zhì)［14-16］。外施MeJA能對植物產(chǎn)生與逆境脅迫相似的作用：激活植物體內(nèi)茉莉酸信號途徑，誘發(fā)防御基因表達，引起系統(tǒng)誘導型抗性［17］。在此過程中，MeJA可調(diào)節(jié)植物次生代謝相關基因的表達從而促進某些產(chǎn)物的合成和積累：Mangas［18］研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能促進積雪草三萜類化合物的合成，但抑制植物甾醇的合成；行玉冰等［19］發(fā)現(xiàn)MeJA調(diào)節(jié)丹參代謝相關酶的表達，促進迷迭香酸的合成；Dai等［20］研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能提高猴頭菌的生物量及麥角甾醇的含量；Liu等［21］通過對何首烏轉(zhuǎn)錄組分析表明，MeJA能顯著影響何首烏有效成分生物合成多個基因的表達。

本試驗研究了外源MeJA對甘草根中甘草酸和甘草苷的含量及其對應的生物合成途徑相關酶基因表達的調(diào)控作用，結果表明20、50 μmol/L MeJA溶液處理后的甘草根中甘草酸含量得到極顯著提高；同時GubAS和GubAO作為甘草酸等三萜類化合物生物合成途徑的關鍵基因，在20 μmol/L MeJA溶液誘導中表達量存在不同程度提高，其中在該濃度下誘導6 h后的表達量達到極顯著提高。推斷中低濃度的MeJA溶液在處理初期對甘草酸的合成和積累具有促進作用，隨著MeJA溶液濃度的提高與處理時間的延長，MeJA對甘草酸生物合成的上調(diào)作用逐漸減弱。同樣，結合MeJA溶液對甘草苷含量及其生物合成途徑中下游基因GuDOCS基因表達量的影響，分析發(fā)現(xiàn)低濃度MeJA溶液在處理初期對甘草根中GuDOCS基因的表達存在促進作用，但未體現(xiàn)甘草苷含量的提高，且隨著MeJA濃度提高與處理時間延長，甘草苷的合成與積累受到抑制，因此可初步推斷MeJA對甘草苷的作用不明顯。

植物次生代謝途徑及其調(diào)控網(wǎng)絡十分復雜，本研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA通過調(diào)控甘草有效成分生物合成途徑相關基因的表達，對不同有效成分的合成和積累有不同的調(diào)控效果，更深入的調(diào)控機制仍需后續(xù)研究。本研究為化學調(diào)控提高栽培甘草的品質(zhì)奠定了基礎，也為甘草資源的保護與可持續(xù)利用提供可行的途徑。

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（責任編輯 白雪娜）

Regulation of methyl jasmonate on secondary metabolism of Glycyrrhiza uralensis root

LIANG Xiao-wei，YANG Quan，LI Dan，CHENG Xuan-xuan，TANG Xiao-min，PAN Li-ming，ZHANG Chun-rong
（School of Traditional Chinese Medicines，Guangdong Pharmaceutical University/Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Production& Development of Cantonese Medicinal Materials，Guangzhou 510006，China；

R932

A

1004-874X（2017）06-0057-06

梁曉薇，楊全，李丹，等.茉莉酸甲酯對甘草根次生代謝的調(diào)控［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（6）：57-62.

2016-10-21

國家自然科學基金（811173488）；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項（201207002）；中國中醫(yī)科學院中藥研究所項目（2011ZDXK-01）；廣東省中醫(yī)藥局建設中醫(yī)藥強省科研項目（20142090）

梁曉薇（1991-），女，碩士，E-mail：1329509951@qq.com

張春榮（1976-），男，博士，講師，E-mail：zhangchunr@21cn.com