海藻糖和胎牛血清對(duì)人乳腺細(xì)胞HBL-100低溫保存的影響

王美霞 梁瑋 葉萍 劉寶林

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093)

海藻糖和胎牛血清對(duì)人乳腺細(xì)胞HBL-100低溫保存的影響

王美霞 梁瑋 葉萍 劉寶林

(上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093)

建立高質(zhì)量的生物樣本庫至關(guān)重要，低溫保存過程中保護(hù)劑的種類和濃度對(duì)樣本的冷凍效果有很大影響。本文以人乳腺細(xì)胞HBL-100為研究對(duì)象，在Me2SO含量10%的DMEM溶液中分別添加不同濃度海藻糖(0～0.3 mol/L)和不同體積分?jǐn)?shù)FBS(20% ～60%)。采用逐步降溫法，先在-80℃冰箱中慢速降溫4 h，再快速投入到液氮中(-196℃)，凍存7 d后，在37℃水浴鍋中快速搖晃復(fù)溫。分別用臺(tái)盼藍(lán)法、CCK法和24 h貼壁率法檢測(cè)細(xì)胞的成活率，結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，海藻糖和FBS對(duì)細(xì)胞的冷凍效果都有顯著影響。當(dāng)海藻糖濃度一定時(shí)，F(xiàn)BS體積分?jǐn)?shù)越高，細(xì)胞的冷凍效果越好，但不添加海藻糖時(shí)，F(xiàn)BS的作用不明顯;當(dāng)FBS體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，三種檢測(cè)指標(biāo)在海藻糖濃度為0.2 mol/L時(shí)最優(yōu)，且高濃度海藻糖可能會(huì)抑制FBS作用。考慮成本等因素，最適宜凍存人乳腺細(xì)胞HBL-100的凍存液為10%Me2SO+40% ～60%FBS+0.2 mol/L海藻糖。

低溫保存;存活率;海藻糖;胎牛血清

AbstractEstablishing a high-quality biobank is very important，but the cryoprotective agent(CPA)type and concentration have a considerable influence on the cryopreservation effect.In this paper，HBL-100 human breast cells were treated with 10%Me2SO combined with trehalose(0-0.3 mol/L)and fetal bovine serum(FBS;20%-60%)in Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM).Through gradual reduction of the temperature，the cells were cooled in a-80℃ freezer for 4 h and then quickly transferred into liquid nitrogen.After storing for 7 days， the cells were shaken quickly at 37 ℃.The cell survival rate was assessed using the trypan blue test， cell counting kit(CCK)assay， and the attached rations after 24 hours.The results show that， compared with the control group， the effects of the trehalose and FBS are very obvious.In particular， when the trehalose concentration is constant， a higher FBS volume fraction yields a better effect.The FBS has no significant effect without trehalose.Further， when the FBS volume fraction is constant， the optimal effect is obtained for 0.2 mol/L trehalose.A high trehalose concentration may weaken the effect of the FBS.Considering the cost and other factors，the most suitable CPAs for the cryopreservation of HBL-100 human breast cells are 10%Me2SO+40%-60%FBS+0.2 mol/L trehalose.

Keywordscryopreservation;viability;trehalose;fetal bovine serum

乳腺細(xì)胞的研究始于20世紀(jì)50年代，乳腺細(xì)胞可用來研究乳腺生長、發(fā)育和泌乳的分子機(jī)理，還可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培養(yǎng)乳腺生物反應(yīng)器的開發(fā)。近年來，建立健康細(xì)胞、組織樣本庫備受關(guān)注。保持樣本庫中健康細(xì)胞的活性，可以更加有效地保護(hù)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA、RNA等生物信息免受損傷，為進(jìn)一步研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和發(fā)育提供了保證。但是，不同類型細(xì)胞和組織的適宜冷凍方法和條件存在較大差異，目前絕大多數(shù)的生物樣本庫不能很好的保持細(xì)胞的活性。所以，針對(duì)樣本庫中各種類型的細(xì)胞和組織，研究最有效的低溫保存方法具有重要意義。

二甲基亞砜(Me2SO)是目前凍存細(xì)胞最常用的保護(hù)劑，它可以降低保存液的冰點(diǎn)，減少胞內(nèi)冰晶形成[1]。但毒性較大，單獨(dú)使用Me2SO不僅對(duì)細(xì)胞有損傷，而且不能很好的對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行保護(hù)[2]。海藻糖是一種非滲透性保護(hù)劑，不僅能在細(xì)胞外形成高滲，減少胞內(nèi)冰的形成，還具有較高的玻璃化溫度，易形成玻璃態(tài)，一方面避免了低溫對(duì)細(xì)胞膜蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的損傷，另一方面將細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)分子支撐包裹起來，使之不易變形，抑制細(xì)胞膜融合，降低細(xì)胞膜的通透性[3]。有學(xué)者應(yīng)用含不同濃度海藻糖的保護(hù)液，低溫保存肝癌細(xì)胞[4]、犬氣管[5]、卵巢癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞[6]及小鼠受精卵[7]，均取得了良好的保存效果。胎牛血清(FBS)也有助于細(xì)胞的冷凍保存，且在腸道腫瘤組織原代細(xì)胞[8]、牛成纖維細(xì)胞[9]等低溫保存中效果顯著。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過在Me2SO含量10%的細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中添加不同濃度的海藻糖(0 mol/L，0.2 mol/L，0.3 mol/L)及不同體積分?jǐn)?shù)FBS(20%、40%、60%)，采用逐步降溫方式，研究了海藻糖和胎牛血清(FBS)對(duì)人乳腺細(xì)胞HBL-100冷凍效果的影響，為生物樣本庫的大量?jī)龃嫣峁┝艘环N冷凍效果較好、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的冷凍方法。

表1 保護(hù)劑分組Tab.1 The groups of the cryoprotectants

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺細(xì)胞HBL-100(中科院上海生命科學(xué)研究院);胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司);二甲基亞砜(Me2SO)(德國APPLICHEM公司);海藻糖(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);臺(tái)盼藍(lán)染色液(2X)(碧云天生物技術(shù)公司);CCK-8試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥)。

1.2 儀器與設(shè)備

超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);程序降溫盒 (賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司);酶標(biāo)儀(英國柏楉有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 凍存液配制

配制11組不同的凍存液配方，如表1所示，配制前將Me2SO 4℃預(yù)冷[10]，將配制好的凍存液用0.22 μm針式濾器過濾除菌，用封口膜封住瓶口放置于4℃冰箱備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人乳腺細(xì)胞HBL-100接種于含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL 的 DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、70%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，以備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞凍存

取生長處于對(duì)數(shù)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行冷凍。去除培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)液，加入3 mL DHanks液清洗細(xì)胞兩次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，靜置1 min后，吸掉胰蛋白酶溶液，再加2 mL培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打皿壁，使細(xì)胞懸浮，然后吸入離心管中，1 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，每組分別加入配制好的凍存液3 mL，輕輕吹打混勻，在4℃下平衡10 min后，再將3 mL細(xì)胞懸液均分加入3支凍存管中(即設(shè)置3個(gè)重復(fù)組)，并在各凍存管中標(biāo)注細(xì)胞編號(hào)。使凍存管置于程序降溫盒中(降溫速率為1℃/min)，采用逐步降溫法，先放在-80℃冰箱中慢速降溫4 h(降溫速率為1℃/min)，再將凍存管投放到液氮中凍存7 d。

1.3.4 細(xì)胞復(fù)蘇

7 d后從液氮中取出凍存管，在37℃水浴鍋中快速搖晃進(jìn)行復(fù)溫，1 500 r/min離心5 min，并倒掉上清液，然后分別加入1 mL培養(yǎng)基吹打均勻，制備成細(xì)胞懸液。

1.3.5 細(xì)胞檢測(cè)

1)臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力[11]

將凍存前和復(fù)溫后的細(xì)胞吹打混勻后，取50 μL于1.5 mL離心管中，再加入50 μL臺(tái)盼藍(lán)染液染色，混勻后靜止1 min，吸取少量混合液滴加于血球記數(shù)板蓋玻片旁，使液體進(jìn)入記數(shù)室，細(xì)胞呈藍(lán)色為死細(xì)胞，呈無色透明狀為活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)四角大方格中的活細(xì)胞數(shù)，用式(1)計(jì)算細(xì)胞濃度:

根據(jù)細(xì)胞懸液體積計(jì)算總細(xì)胞數(shù)，并用式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率:

2)CCK法檢測(cè)細(xì)胞活力[12]

每組實(shí)驗(yàn)中，取復(fù)溫后的細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/mL)置于96孔培養(yǎng)板中(邊緣孔用無菌PBS填充)，另加一組新鮮對(duì)照組(新鮮細(xì)胞且濃度接近于復(fù)蘇后細(xì)胞)，一組不含細(xì)胞的培養(yǎng)基組(調(diào)零空)，每組設(shè)有三個(gè)平行。每孔加入100 μL待測(cè)液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，然后向每孔加入10 μL CCK溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。按式(3)計(jì)算細(xì)胞活力[13]。

3)24 h貼壁率[14]

復(fù)溫后取等體積細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，加入8 mL培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃、5%CO2、70%濕度)，24 h后收集培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，并用D-Hanks液(2 mL)清洗兩次，收集上清液，計(jì)數(shù)未貼壁細(xì)胞;然后用胰酶消化后加入培養(yǎng)基，1 500 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，按式(4)計(jì)算細(xì)胞貼壁率:

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0軟件中ANOVA(Analysis of Variance)過程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、Duncan氏多重比較和雙因素分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FBS對(duì)人乳腺細(xì)胞HBL-100低溫保存效果的影響

凍存前，用臺(tái)盼藍(lán)染色得到新鮮細(xì)胞的存活率為(96.32±2.01)%。當(dāng)海藻糖濃度分別保持恒定值時(shí)，不同體積分?jǐn)?shù)FBS的細(xì)胞冷凍后細(xì)胞存活率和24 h貼壁率如表2所示。

由表2可以看出，三種檢測(cè)方法得到的結(jié)果趨勢(shì)一致。實(shí)驗(yàn)組1～9、對(duì)照組2都與對(duì)照組1有顯著性差異(P＜0.05)，說明加入低溫保護(hù)劑(10%Me2SO、20% ～60%FBS和海藻糖)可以顯著提高細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)組2～9與對(duì)照組2相比也有顯著性差異(P＜0.05)，說明在10%Me2SO基礎(chǔ)上添加適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)FBS和適宜濃度的海藻糖有助于提高細(xì)胞存活率。

當(dāng)海藻糖濃度一定時(shí)，隨著FBS體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞的存活率、CCK存活率和24 h貼壁率均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且有顯著性差異(P＜0.05);但當(dāng)海藻糖濃度為0 mol/L和0.3 mol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)7組的存活率、24 h貼壁率與對(duì)照組2相比略低，但差異性不顯著(P＞0.05)，即此時(shí)的20%FBS對(duì)細(xì)胞冷凍沒有促進(jìn)作用;實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組的CCK存活率沒有顯著性差異(P＞0.05)，說明此時(shí)的20%FBS和40%FBS對(duì)細(xì)胞冷凍效果無差別。

2.2 海藻糖對(duì)人乳腺細(xì)胞HBL-100低溫保存效果的影響

當(dāng)FBS體積分?jǐn)?shù)分別保持恒定時(shí)，不同濃度海藻糖的細(xì)胞冷凍后細(xì)胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率如表3所示。

由表3可以看出，當(dāng)FBS體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著海藻糖濃度的增加，細(xì)胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率都是先增加后減小，且差異顯著(P＜0.05);海藻糖濃度為0.2 mol/L時(shí)細(xì)胞低溫保存效果最好。20%FBS條件下，添加0.3 mol/L海藻糖的細(xì)胞存活率要低于0 mol/L海藻糖(P＜0.05)，CCK存活率和24 h貼壁率略高，但差異不顯著(P＞0.05);而40%FBS和60%FBS條件下，0.3 mol/L海藻糖的CCK存活率和24 h貼壁率要高于0 mol/L海藻糖，且差異顯著(P＜0.05)。說明高濃度海藻糖可能會(huì)抑制20%FBS的作用，但增加FBS體積分?jǐn)?shù)一定程度上可以減少抑制作用。

2.3 雙因素方差分析結(jié)果

在A(海藻糖濃度)和B(FBS體積分?jǐn)?shù))兩個(gè)因素下，細(xì)胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率的雙因素方差分析結(jié)果如表4所示。

由表4可知，從整體上看，不同濃度海藻糖對(duì)HBL-100細(xì)胞存活率的影響是極其顯著的(P＜0.01)，對(duì)CCK存活率和24 h貼壁率的影響是顯著的(P＜0.05);不同體積分?jǐn)?shù)FBS對(duì)HBL-100細(xì)胞的存活率和24 h貼壁率是極其顯著的(P＜0.01)，對(duì)CCK存活率影響是顯著的(P＜0.05);FBS與海藻糖

的交互作用不顯著(P＞0.05)。由最終結(jié)果來看，冷凍效果最好的凍存液組合是10%Me2SO+60%FBS+0.2 mol/L海藻糖，細(xì)胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率分別為(87.93±0.95)%、(91.82±0.62)%和(88.01±0.65)%。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)FBS的細(xì)胞冷凍后存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.2 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different volume fraction of FBS(±s,n=3)

表2 不同體積分?jǐn)?shù)FBS的細(xì)胞冷凍后存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.2 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different volume fraction of FBS(±s,n=3)

注:用Duncan's multiple range test法進(jìn)行多重比較，同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P＞0.05)。

編號(hào) 海藻糖濃度/(mol/L) FBS體積分?jǐn)?shù)/% 細(xì)胞存活率/% CCK存活率/% 24 h貼壁率/%對(duì)照組1對(duì)照組2——0.67±0.03h0.78±0.11h1.23±0.37g44.43±1.23f42.01±0.66g52.13±0.45f1 2 3 0 20 46.32±0.32f44.81±0.48f48.33±0.51f40 53.33±0.67e47.61±0.81f55.72±0.35e60 71.22±0.79b61.07±0.53d63.22±0.15d4 5 6 0.2 20 63.45±1.27d55.79±1.03e65.38±0.19c40 69.31±1.08b70.78±0.72b70.10±1.45b60 87.93±0.95a91.82±0.62a88.01±0.65a7 8 9 0.3 20 37.30±0.78g47.56±0.36f50.33±1.34f40 53.00±1.12e54.04±0.72e66.58±0.47c60 67.08±1.46c64.09±0.34c72.32±0.45b

表3 不同濃度海藻糖的細(xì)胞冷凍存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.3 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different concentration of trehalose(±s,n=3)

表3 不同濃度海藻糖的細(xì)胞冷凍存活率、CCK存活率和24 h貼壁率(±s,n=3)Tab.3 The survival rate,CCK assay and the attached rations after 24 h of cells with different concentration of trehalose(±s,n=3)

注:用Duncan’s multiple range test法進(jìn)行多重比較，同列標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)，標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P＞0.05)。

編號(hào) FBS體積分?jǐn)?shù)/% 海藻糖濃度/(mol/L) 細(xì)胞存活率/% CCK存活率/% 24 h貼壁率/%1 4 7 0 20 46.32±0.32f44.81±0.48f48.33±0.51f0.2 63.45±1.27d55.79±1.03e65.38±0.19c0.3 37.30±0.78g47.56±0.36f50.33±1.34f2 5 8 0 40 53.33±0.67e47.61±0.81f55.72±0.35e0.2 69.31±1.08b70.78±0.72b70.10±1.45b0.3 53.00±1.12e54.04±0.72e66.58±0.47c3 6 9 0 60 71.22±0.79b61.07±0.53d63.22±0.15d0.2 87.93±0.95a91.82±0.62a88.01±0.65a0.3 67.08±1.46c64.09±0.34c72.32±0.45b

表4 細(xì)胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率的雙因素方差分析結(jié)果Tab.4 Results of double-factor analysis for the survival rate、CCK assay and the attached rations after 24 h

3 討論

3.1 檢測(cè)方法之間的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)采用了三種方法檢測(cè)細(xì)胞的凍存效果。臺(tái)盼藍(lán)染色法是最常用的檢測(cè)細(xì)胞活性的方法[11]。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率指標(biāo)基本上能夠反映出海藻糖和FBS對(duì)細(xì)胞凍存效果的影響，但該方法操作誤差偏大，一般還需要用MTT法或CCK法檢測(cè)。有文獻(xiàn)顯示CCK-8法比傳統(tǒng)MTT法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠且重復(fù)性好[15]。CCK法的原理是試劑中的WST-8在電子載體的作用下能被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臢物，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測(cè)樣品吸光度[12]。實(shí)驗(yàn)中CCK存活率結(jié)果從整體上看比臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)的存活率略高，可能是因?yàn)樵贑CK-8試劑染色過程中，一部分細(xì)胞雖然細(xì)胞膜受損，但因具有酶的活性會(huì)被檢測(cè)為“活細(xì)胞”。所以兩種方法聯(lián)合使用更能全面反映細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)組中24 h貼壁率與前兩種方法的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，它著重于檢測(cè)細(xì)胞復(fù)溫培養(yǎng)后的存活能力。

3.2 海藻糖和FBS的作用機(jī)制

實(shí)驗(yàn)中用三種方法檢測(cè)的細(xì)胞存活率、CCK存活率和24 h貼壁率的結(jié)果是一致的。在不加任何保護(hù)劑凍存后，細(xì)胞幾乎全部死亡。而添加保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)組冷凍效果都顯著(P＜0.05)。甘油是最早被使用的低溫保護(hù)劑，但有研究發(fā)現(xiàn)在同等條件下，甘油的冷凍效果遠(yuǎn)低于Me2SO[9]。有學(xué)者研究出最適宜凍存人肝細(xì)胞的Me2SO濃度是10% ～12%[16]，人肝癌細(xì)胞Hep-G2為10% ～20%[17]，293T細(xì)胞為5%～10%[18]。實(shí)驗(yàn)中以10%Me2SO為基礎(chǔ)凍存液，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，單純的10%Me2SO并不能很好的凍存細(xì)胞，而加入不同濃度海藻糖和不同體積分?jǐn)?shù)FBS對(duì)細(xì)胞冷凍效果影響顯著(P＜0.05)。表2顯示FBS體積分?jǐn)?shù)越高，細(xì)胞的冷凍效果越好，這是因?yàn)镕BS是培養(yǎng)細(xì)胞、保持細(xì)胞活性最重要的成分，還可以提供結(jié)合蛋白，結(jié)合有毒金屬和熱源物質(zhì)，起解毒作用。表3顯示隨著海藻糖濃度的增加，存活率和24 h貼壁率先增加后減小，在0.2 mol/L時(shí)達(dá)到最大，說明海藻糖凍存細(xì)胞的確可以產(chǎn)生很好的效果，但需要控制濃度。濃度過高時(shí)，一方面會(huì)影響細(xì)胞膜表面酶的活性，減少M(fèi)e2SO和FBS進(jìn)入胞內(nèi)，另一方面會(huì)使細(xì)胞過度脫水而死亡[19];濃度過低時(shí)又起不到保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的作用。這一點(diǎn)與S.Blake等[4]的研究結(jié)果相吻合。實(shí)際上海藻糖的作用原理還包括:“水替代”假說、“玻璃態(tài)”假說、“優(yōu)先排阻”假說，在紅細(xì)胞、血小板及生殖細(xì)胞等的離體長期保存中，均表現(xiàn)出獨(dú)特的功能[20]。表4結(jié)果顯示海藻糖和FBS的交互作用不顯著(P＞0.05)，說明它們相互之間的影響不大;但從最終結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)6組的結(jié)果最好，說明它們協(xié)同作用可以產(chǎn)生更好的凍存效果。

在實(shí)際應(yīng)用中，考慮到胎牛血清成本、細(xì)胞復(fù)溫后貼壁生長速度等因素，由表2可知:實(shí)驗(yàn)5組、實(shí)驗(yàn)3組和實(shí)驗(yàn)9組比較，CCK存活率較高且差異顯著(P＜0.05)，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)存活率和24 h貼壁率略低但差異不顯著(P＞0.05)。即10%Me2SO+40%FBS+0.2 mol/L海藻糖的凍存液組合也能實(shí)現(xiàn)很好的凍存效果。

3.3 凍存過程

目前大多數(shù)生物樣本庫采用-80℃冰箱與液氮罐保存樣本。液氮中可以實(shí)現(xiàn)長久保存[21]，因?yàn)樵?196℃下細(xì)胞的生命活動(dòng)幾乎完全停止。但凍存過程中的降溫速率要嚴(yán)格控制[22]。J.N.V.Reyes等[23]采用慢速降溫和玻璃化對(duì)牛胚胎冷凍保存進(jìn)行研究，證明玻璃化方式效果最好。由于實(shí)驗(yàn)條件等原因，本實(shí)驗(yàn)只研究了逐步降溫法，為更進(jìn)一步增強(qiáng)保存效果，還需要對(duì)不同降溫方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)為研究其他乳腺類細(xì)胞的低溫保存提供了一定的參考價(jià)值。但針對(duì)樣本庫中其他類細(xì)胞或組織，海藻糖是否適用、適宜濃度是多少、是否有更好的可替代保護(hù)劑、其他降溫方式的效果等問題都有待探索。

4 結(jié)論與建議

本實(shí)驗(yàn)以人乳腺細(xì)胞HBL-100為研究對(duì)象，在10%Me2SO的DMEM中添加20%～60%FBS和0～0.3 mol/L海藻糖，研究海藻糖和FBS對(duì)細(xì)胞低溫保存效果的影響。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法、CCK法和24 h貼壁率法檢測(cè)細(xì)胞活性，得出結(jié)論:當(dāng)海藻糖濃度一定時(shí)，隨著FBS體積分?jǐn)?shù)的增加，三種檢測(cè)指標(biāo)都顯著增加;但當(dāng)不添加海藻糖時(shí)，F(xiàn)BS的促進(jìn)作用不明顯;當(dāng)FBS體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，細(xì)胞的存活率在海藻糖濃度為0.2 mol/L時(shí)最高。凍存液組合為10%Me2SO+60%FBS+0.2 mol/L海藻糖時(shí)的三種檢測(cè)指標(biāo)最高。考慮到胎牛血清成本及復(fù)溫后細(xì)胞生長速度等因素，選擇40%FBS+0.2 mol/L海藻糖也能達(dá)到很好的冷凍效果。本文僅探討了一種細(xì)胞在兩種保護(hù)劑變化下冷凍效果的影響，對(duì)其他細(xì)胞或組織來說，保護(hù)劑的種類和用量有待進(jìn)一步研究，以更好的完善生物樣本庫體系。

[1]DABOS K J，PARKINSORT J A，HEWAGE C，et al.H-1 NMR spectroscopy as a tool to evaluate key metabolic functions of primary porcine hepatocytes after cryopreservation[J].NMR Biomed，2002，15(3):241-250.

[2]MOTTA J P，PARAGUASSú-BRAGA F H，BOUZAS L F，et al.Evaluation of intracellular and extracellular trehalose as a cryoprotectant of stem cells obtained from umbilical cord blood[J].Cryobiology， 2014， 68(3):343-348.

[3]楊波，周燕，劉寶林，等.肝細(xì)胞低溫保存的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2011，30(2):308-311.(YANG Bo， ZHOU Yan， LIU Baolin， et al.Studies on cryopreservation of human hepatocytes[J].Chinese Journal of Biomedical Engineering， 2011， 30(2):308-311.)

[4]BLAKE S，QUINN O，DAVID G，et al.Cryopreservation of hepatocyte(HepG2)cell monolayers:impact of trehalose[J].Cryobiology， 2014， 69(2):281-290.

[5]王連召，周剛，王化冰，等.深低溫冷凍保存氣管的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2002，40(Suppl.1):636-636.(WANG Lianzhao， ZHOU Gang， WANG Huabing，et al.Study on cryopreservation of tracheal tube[J].Chinese Journal of Plastic Surgery， 2002， 18(Suppl.1):636-636.)

[6]SUI L， NOMURA R， DONG Y， et al.Cryoprotective effects of D-allose on mammalian cells[J].Cryobiology，2007，55(2):87-92.

[7]孫燕香，姜國誠.玻璃化冷凍保存小鼠受精卵的研[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，21(3):77-79.(SUN Yanxiang，JIANG Guocheng.Study on the vitrification of mouse fertilized eggs[J].Journal of Guangxi Normal University，2003，21(3):77-79.)

[8]陳光，蔡慧云，魏曉軍，等.胃腸道腫瘤凍存組織原代細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床軍醫(yī)雜志，2011，39(4):605-607.(CHEN Guang， CAI Huiyun， WEI Xiaojun，et al.Study on cryopreservation of primary cell of gastrointestinal tumor[J].Clinical Medical Journal， 2011， 39(4):605-607.)

[9]程金華，朱化彬，孫秀柱，等.冷凍保護(hù)劑和胎牛血清對(duì)牛成纖維細(xì)胞冷凍效果的影響[J].中國畜牧雜志，2006， 42(21):12-14.(CHENG Jinhua， ZHU Huabin，SUN Xiuzhu，et al.Effects of cryopreservation and fetal bovine serum on the cryopreservation of bovine fibroblast cells[J].Chinese Journal of Animal Science， 2006， 42(21):12-14.)

[10]王亮，劉婷婷，彭濤，等.荷斯坦奶牛耳組織成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及冷凍保存方法研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006(5):9-12.(WANG Liang，LIU Tingting，PENG Tao， et al.Study on isolation， culture and cryopreservation of holstein cattle-ear organization and fibroblasts[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2006(5):9-12.)

[11]司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)[M].北京:世界圖書出版社，2004.(SITU Zhenqiang.Cell culture[M].Beijing:World Book Publishing House，2004.)

[12]TOMINAGA H，ISHIYAMA M，OHSETO F，et al.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J].Analytical Communications， 1999， 36(2):47-50.

[13]孫健，梅晶，趙曉紅，等.植物活性成分對(duì)細(xì)胞存活率的影響及其測(cè)定方法的比較研究[J].食品科學(xué)，2012，33(19):119-123.(SUN Jian， MEI Jing， ZHAO Xiaohong，et al.Effects of bioactive plant components on cell viability and comparison of cell viable assays[J].Food Science， 2012，33(19):119-123.)

[14]姚嵐，梁瑋，劉寶林.人肝癌細(xì)胞Hep-G2的低溫保存研究[J].制冷學(xué)報(bào)，2015，36(2):95-100.(YAO Lan，LIANG Wei，LIU Baolin.Study on cryopreservation of human hepatoma Hep-G2 cell[J].Journal of Refrigeration，2015，36(2):95-100.)

[15]熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性之測(cè)試條件比較[J].激光生物學(xué)報(bào)，2007，16(5):559-562.(XIONG Jianwen， XIAO Hua， ZHANG Zhenxi.A comparison of test conditions for the cell activity by MTT and CCK-8 methods[J].Journal of Laser Biology， 2007，16(5):559-562.)

[16]GUILLOUZO A，RIALLAND L，F(xiàn)AUTREL A，et al.Survival and function of isolated hepatocytes after cryopreservation[J].Chemico-Biological Interactions， 1999， 121(1):7-16.

[17]NAGAHARA Y，SEKINE H，OTAKI M，et al.Use of high concentrations of dimethyl sulfoxide for cryopreservation of HepG2 cells adhered to glass and polydimethylsiloxane matrices[J].Cryobiology， 2016， 72(1):53-59.

[18]李佳佳，程騰，賀小英，等.二甲基亞砜和胎牛血清對(duì)293T細(xì)胞冷凍效果的影響[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013， 26(2):217-220.(LI Jiajia， CHENG Teng， HE Xiaoying，et al.Effects of DMSO and fetal bovine serum on the cryopreservation of 293T cells[J].Journal of Xinyang Normal University， 2013， 26(2):217-220.)

[19]LEE Y A，KIM Y H，KIM B J，et al.Cryopreservation in trehalose preserves functional capacity of murine spermatogonial stem cells[J].Plos One， 2013， 8(1):e54889.

[20]KANIAS T，ACKER J P.Trehalose loading into red blood cells is accompanied with hemoglobin oxidation and membrane lipid peroxidation[J].Cryobiology， 2009， 58(2):232.

[21]于穎彥，劉炳亞，朱正綱.腫瘤組織庫建立的進(jìn)展及意義[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2009，8(1):9-11.(YU Yingyan， LIU Bingya， ZHU Zhenggang.Advances in the establishment of tumor tissue bank and significance[J].Journal of Diagnostics Concepts&Practice， 2009， 8(1):9-11.)

[22]華澤釗，任禾盛.低溫生物醫(yī)學(xué)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社，1995.(HUA Zezhao，REN Hesheng.Low temperature biomedical technology[M].Beijing:Science Press，1995.

[23]REYES J N V，JARAMILLO L C.Cryopreservation method and composition of the vitrification solution affect viability of in vitro bovine embryos[J].Revista Colombiana De Ciencias Pecuarias，2016.

Effects of Trehalose and Fetal Bovine Serum on Cryopreservation of HBL-100 Human Breast Cells

Wang Meixia Liang Wei Ye Ping Liu Baolin
(Institute of Biothermal Science and Technology， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai，200093，China)

R318.52;TB61+1

A

國家自然科學(xué)基金(50576059)資助項(xiàng)目。(The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.50576059).)

2016年10月18日

0253-4339(2017)05-0107-07

10.3969/j.issn.0253-4339.2017.05.107

劉寶林，男，教授，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，13636524955，E-mail:blliuk@163.com。 研究方向:細(xì)胞、組織和器官的低溫保存、食品冷凍冷藏、食品藥品的冷凍干燥技術(shù)等。

About the corresponding authorLiu Baolin， male， professor， School of Medical Devices and Food Science， Shanghai University of Science and Technology， +86 13636524955，E-mail:blliuk@163.com.Research fields:the cryopreservation of cells， tissues and organs， food freezing and cold storage，food and drug refrigeration and drying technology.