鉛和得克隆聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)毒性作用

陳香平，黃長(zhǎng)江，陳元紅，劉濱，劉翠平，朱亞先，張勇,*

1. 近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廈門大學(xué))，廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，廈門 3611022. 溫州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，溫州 3250353. 溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，溫州 3250274. 廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，廈門 361102

鉛和得克隆聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)毒性作用

陳香平1，黃長(zhǎng)江2，陳元紅2，劉濱3，劉翠平3，朱亞先4，張勇1,*

1. 近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廈門大學(xué))，廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，廈門 3611022. 溫州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，溫州 3250353. 溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，溫州 3250274. 廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，廈門 361102

以斑馬魚(Danio rerio)為研究對(duì)象，探討鉛(Pb)、得克隆(DP)及二者聯(lián)合急性暴露對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)毒性作用。結(jié)果表明，Pb(5、20 μg·L-1)和DP(15、60 μg·L-1)單獨(dú)暴露均會(huì)引起斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)頻率增加，觸摸反應(yīng)能力和自由游泳活力下降，并且抑制初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，加劇尾部細(xì)胞凋亡。但與20 μg·L-1Pb單獨(dú)暴露相比，高劑量聯(lián)合暴露(20 μg·L-1Pb + 60 μg·L-1DP)使斑馬魚的自主運(yùn)動(dòng)頻率顯著降低(P < 0.05)，觸摸反應(yīng)能力和自由游泳活力顯著增強(qiáng)(P < 0.05)，初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度顯著增加(P < 0.05)，尾部細(xì)胞凋亡減少。與5 μg·L-1Pb單獨(dú)暴露相比，低劑量聯(lián)合暴露(5 μg·L-1Pb + 15 μg·L-1DP)也顯著減少斑馬魚尾部的細(xì)胞凋亡(P < 0.05)。上述結(jié)果表明，Pb或DP單獨(dú)暴露對(duì)斑馬魚均可引起神經(jīng)毒性作用；但二者聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)、觸摸反應(yīng)以及自由游泳活力的影響則表現(xiàn)為拮抗作用。

鉛；得克隆；斑馬魚；胚胎；神經(jīng)毒性；聯(lián)合暴露

Received9 November 2016accepted17 December 2016

Abstract: Neurotoxic effects of acute exposure to lead (Pb) or Dechlorane Plus (DP), or both were investigated using zebrafish (Danio rerio) embryos. Results showed that exposure to Pb (5, 20 μg·L-1) or DP (15, 60 μg·L-1) alone increased spontaneous movement, decreased touch response and free-swimming activity, inhibited axonal growth of primary motoneuron and induced cell apoptosis in zebrafish embryos. Co-exposure to 20 μg·L-1Pb and 60 μg·L-1DP significantly decreased spontaneous movement (P < 0.05), enhanced touch response and free-swimming activity (P < 0.05), increased axonal length of primary motoneuron (P < 0.05) and reduced cell apoptosis in zebrafish when compared to 20 μg·L-1Pb exposure alone. Co-exposure to 5 μg·L-1Pb and 15 μg·L-1DP also significantly decreased cell apoptosis on the tail region when compared to 5 μg·L-1Pb exposure alone (P < 0.05). These results demonstrated that Pb or DP exposure alone could induce neurobehavioral toxicity in zebrafish, but Pb and DP co-exposure had antagonistic effects on spontaneous movements, touch response and free swimming activity.Keywords: lead; Dechlorane Plus; zebrafish; embryo; neurotoxicity; co-exposure

鉛(Pb)是一種具有生物毒性的重金屬[1]，得克隆(DP)則為一種添加型氯代阻燃劑，二者均為電子電器生產(chǎn)的重要原料。長(zhǎng)期大量和原始粗放型的電子垃圾拆解活動(dòng)已導(dǎo)致我國許多地區(qū)Pb和DP污染嚴(yán)重[2-4]，在污染區(qū)域的水、土壤、沉積物、食物[5-8]及人的頭發(fā)和血液[9-11]中均有檢出。

毒理學(xué)研究表明，Pb具有神經(jīng)、生殖、免疫和肝臟等多種毒性，但神經(jīng)系統(tǒng)是Pb中毒后機(jī)體最敏感的部位，也是Pb作用的主要靶標(biāo)[1]。低濃度的Pb可引起兒童注意力不集中、多動(dòng)和易怒；高濃度的Pb則會(huì)延緩發(fā)育，影響學(xué)習(xí)和記憶，甚至導(dǎo)致大腦壞死或死亡[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，Pb暴露會(huì)改變斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)節(jié)律、降低光暗刺激反應(yīng)速度及削弱學(xué)習(xí)和記憶能力[13]。

目前關(guān)于DP的毒性報(bào)道較少，僅限于DP生產(chǎn)廠OxyChem公司提供的毒性測(cè)試數(shù)據(jù)[14]和2008年美國環(huán)保局(EPA)發(fā)布的高產(chǎn)量化合物檢測(cè)報(bào)告[15]。毒性測(cè)試報(bào)告顯示，DP急性毒性較低，但長(zhǎng)期吸入和皮膚接觸高濃度的DP均會(huì)引起肺、肝臟和生殖器官等一定程度的組織病變。近年來，研究表明DP對(duì)鵪鶉、大鼠和中華鱘幼魚均具有肝臟毒性[16-18]。此外，DP能夠干擾斑馬魚體內(nèi)甲狀腺激素水平[19]，以及改變蚯蚓乙酰膽堿酯酶的活性[20]。甲狀腺激素和乙酰膽堿酯酶均與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞密切相關(guān)，這表明DP對(duì)斑馬魚具有潛在的神經(jīng)毒性作用。然而DP和Pb聯(lián)合暴露對(duì)生物體的神經(jīng)毒性研究卻鮮有報(bào)道。

斑馬魚(Danio rerio)體形小、發(fā)育快，可進(jìn)行高通量篩選；其神經(jīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單但可支配復(fù)雜的活動(dòng)，能夠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、記憶等相關(guān)評(píng)價(jià)，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物神經(jīng)行為毒性評(píng)價(jià)[21]。本文擬以斑馬魚為模式動(dòng)物，考察Pb和DP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)行為毒性，以期為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)環(huán)境中Pb和DP復(fù)合污染所引起的生物健康效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：Video Track 3.5斑馬魚行為分析系統(tǒng)(法國Viewpoint公司)；RXZ-300C恒溫光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；TE 2000-U熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；SMZ1500體視顯微鏡(日本Nikon公司)；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；7000 ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)。

主要試劑：三水合醋酸鉛(純度> 98%，美國AccuStandard公司)，DP (純度> 97%，江蘇安邦電化有限公司)，syn-DP和anit-DP(純度> 98%，美國AccuStandard公司)，二甲基亞砜(DMSO)(A.R.，西隴化工股份有限公司)，吖啶橙(AO)(A.R.，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚由美國Oregon州立大學(xué)分子毒理研究中心提供，養(yǎng)殖于美國Aquatic Habitats公司生產(chǎn)的全封閉循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫維持在(28 ± 1) ℃，溶解氧不低于7 mg·L-1，光周期為14 h:10 h(晝∶夜)，喂養(yǎng)方法參考Westerfield的方法[22]。

1.3 Pb和DP聯(lián)合暴露方法

DP和Pb染毒濃度分別參照劉陽[23]和Zhu等[24]的報(bào)道，以及預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選的DP和Pb染毒濃度，該濃度對(duì)斑馬魚的致死和致畸率均小于5%，采用3 × 3析因設(shè)計(jì)方法進(jìn)行急性染毒實(shí)驗(yàn)。斑馬魚胚胎自6 hpf(受精后6 h)開始急性染毒，Pb和DP的單一染毒以及二者聯(lián)合染毒同時(shí)進(jìn)行，濃度組分別為0(DMSO體積比為0.1%)，Pb(5、20 μg·L-1)，DP(15、60 μg·L-1)和Pb + DP(5 + 15、5 + 60、20 +15、20 + 60 μg·L-1)。

1.4 斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為的測(cè)定

為考察Pb和DP染毒對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為的影響，測(cè)試斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)、觸摸刺激反應(yīng)、自由游泳活力和光周期刺激反應(yīng)。在24 hpf時(shí)，體式顯微鏡錄像記錄每組斑馬魚一分鐘內(nèi)自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)。在48 hpf時(shí)，用睫毛輕觸預(yù)先經(jīng)蛋白酶E脫膜后的斑馬魚胚胎尾部背側(cè)，體式顯微鏡下測(cè)試每組斑馬魚對(duì)觸摸刺激產(chǎn)生逃生反應(yīng)的游動(dòng)距離。在96 hpf時(shí)，斑馬魚脫毒后轉(zhuǎn)移至24孔板中；培養(yǎng)至120 hpf時(shí)，放入斑馬魚行為分析系統(tǒng)中，依次進(jìn)行15 min連續(xù)光照下的自由游泳行為和25 min持續(xù)光周期刺激反應(yīng)的測(cè)試，光暗周期為暗-亮-暗-亮-暗，每個(gè)周期均為5 min。

1.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)情況

在48 hpf時(shí)，脫膜的斑馬魚胚胎先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛(PFA)4 ℃固定24 h，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的胰蛋白酶冰上消化25 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的PFA室溫固定10 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的山羊血清封閉1 h，然后用一抗znp1(1∶250) 4 ℃孵育24 h，再用二抗Alexa fluor 488標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白(1∶1 000)室溫孵育4 h，最后在倒置熒光顯微鏡下拍照測(cè)量初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度。

1.6 胚胎病理學(xué)觀察

AO染色可以反映細(xì)胞凋亡情況[25]。在96 hpf時(shí)，斑馬魚胚胎用AO溶液(5 mg·L-1)避光染色45 min，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)麻醉后，熒光顯微鏡拍照觀察。

1.7 斑馬魚體內(nèi)Pb和DP蓄積含量測(cè)定

在120 hpf時(shí)，每組選取100條斑馬魚，冷凍干燥并稱重，經(jīng)微波消解、趕酸和定容后，ICP-MS測(cè)定魚體內(nèi)Pb的蓄積含量[26]。冷凍干燥的斑馬魚，加入5 mL正己烷充分研磨，超聲萃取30 min，提取3次，氮吹定容后，GC-MS測(cè)定斑馬魚體內(nèi)DP的蓄積含量[27]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS，Chicago，IL，USA)進(jìn)行單因子方差分析(One-Way ANOVA)。采用雙因子方差分析法評(píng)價(jià)Pb和DP的聯(lián)合作用，當(dāng)P < 0.05時(shí)，說明2個(gè)因素具有拮抗或協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。當(dāng)P < 0.05或P < 0.01時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Pb和DP對(duì)斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)行為的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在24 hpf時(shí)對(duì)照組斑馬魚胚胎1 min內(nèi)的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)為(6.2 ± 0.2)次，Pb和DP單獨(dú)暴露組斑馬魚的自主運(yùn)動(dòng)頻率均顯著增加，且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1A)。但是，聯(lián)合暴露組(20 μg·L-1Pb +15 μg·L-1DP)和(20 μg·L-1Pb + 60 μg·L-1DP)斑馬魚1 min內(nèi)的自主運(yùn)動(dòng)次數(shù)分別為(7.6 ± 0.4)次和(7.5 ± 0.3)次，均顯著低于20 μg·L-1Pb單獨(dú)染毒組的(9.5 ± 0.4)次(P < 0.05)。

觸摸反應(yīng)是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中逃生反應(yīng)的一個(gè)本能表現(xiàn)，Müller等[28]認(rèn)為斑馬魚胚胎在48 hpf時(shí)對(duì)觸摸刺激敏感，并能以游動(dòng)方式逃離。在48 hpf時(shí)，與對(duì)照組相比，Pb和DP單獨(dú)暴露組斑馬魚胚胎的觸摸反應(yīng)能力均呈下降趨勢(shì)，且具有劑量依賴性(圖1B)。其中，對(duì)照組胚胎對(duì)觸摸刺激的游動(dòng)距離為(7.6 ± 0.7) mm，顯著高于60 μg·L-1DP處理組的(4.8 ± 0.7) mm(P < 0.05)，且亦顯著高于20 μg·L-1Pb染毒組的(3.6 ± 0.6) mm(P < 0.01)。但聯(lián)合暴露組(20 μg·L-1Pb + 60 μg·L-1DP)斑馬魚的游動(dòng)距離(5.6 ± 0.7) mm顯著高于20 μg·L-1Pb單獨(dú)暴露組(P < 0.05)。

為進(jìn)一步研究Pb和DP暴露對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為的影響，在120 hpf時(shí)測(cè)試連續(xù)10 min光照下的游泳速度，即自由游泳活力。如圖1C所示，Pb(5、20 μg·L-1)單獨(dú)暴露均顯著降低了斑馬魚的游泳速度(P < 0.01)；DP單獨(dú)暴露組斑馬魚泳速也隨染毒濃度的增加而降低，且60 μg·L-1DP組與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性差異(P < 0.05)。但與20 μg·L-1Pb單獨(dú)暴露組相比，聯(lián)合暴露組(20 μg·L-1Pb + 60 μg·L-1DP)斑馬魚的自由游泳活力則顯著增強(qiáng)(P < 0.05)。雙因子方差分析結(jié)果表明，Pb和DP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)頻率、觸摸反應(yīng)游動(dòng)距離和自由游泳活力的影響存在交互作用且為拮抗效應(yīng)(P < 0.05)。

光周期刺激測(cè)試是運(yùn)動(dòng)行為學(xué)研究中較為常用的方法之一[29]。從圖1D可見，在120 hpf時(shí)，由暗轉(zhuǎn)明時(shí)，對(duì)照組和染毒組斑馬魚的泳速均表現(xiàn)劇降；由明轉(zhuǎn)暗時(shí)，泳速則劇增，這表明Pb和DP染毒對(duì)斑馬魚的視力均未產(chǎn)生不利影響。與自由游泳活力相似，在光暗周期刺激測(cè)試中，20 μg·L-1Pb單一暴露組或與DP(15、60 μg·L-1)復(fù)合暴露組斑馬魚的平均泳速均降低，并且在每個(gè)暗周期內(nèi)，20 μg·L-1Pb單一暴露均顯著降低了斑馬魚的平均泳速(P < 0.05)，但高濃度聯(lián)合暴露(20 μg·L-1Pb + 60 μg·L-1DP)卻削弱了Pb對(duì)斑馬魚游泳行為的影響。

圖1 Pb和得克隆(DP)對(duì)斑馬魚(A)自主運(yùn)動(dòng)，(B)觸摸反應(yīng)，(C)自由游泳速度和(D)光周期測(cè)試中游泳速度的影響注：+表示相同Pb濃度下，Pb單獨(dú)暴露組和與DP聯(lián)合暴露組呈現(xiàn)顯著差異，*表示Pb單獨(dú)暴露組和對(duì)照組呈現(xiàn) 顯著差異(圖1A、B和C)；*P < 0.05和**P < 0.01表示暴露組和對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異(圖1D)。Fig. 1 Effects of co-exposure to Pb and Dechlorane Plus (DP) on zebrafish in (A) spontaneous movement, (B) touch response, (C) speed of free swimming or (D) speed of the dark-to-light photoperiod stimulation testNote: + indicate significant differences between Pb exposure alone and co-exposure to DP at the same concentration of Pb, * indicate significant differences between Pb treatment and controls (Fig. 1A, B and C). *P < 0.05 and **P < 0.01 represent significant differences between exposure groups and control group (Fig. 1D).

2.2 Pb和DP對(duì)初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，Pb和DP單獨(dú)暴露組斑馬魚的軸突長(zhǎng)度均顯著短于對(duì)照組(P < 0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這說明Pb和DP染毒后斑馬魚的初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)均受到明顯的抑制。但是聯(lián)合暴露組(20 μg·L-1Pb +15 μg·L-1DP)和(20 μg·L-1Pb + 60 μg·L-1DP)斑馬魚的軸突長(zhǎng)度分別為(56.1 ± 7.9) mm和(59.7 ± 9.4) mm，均顯著大于20 μg·L-1Pb單獨(dú)暴露組的(50.6 ± 9.5) mm(P < 0.05)。

2.3 Pb和DP對(duì)斑馬魚細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，對(duì)照組斑馬魚尾部細(xì)胞只呈現(xiàn)少許的凋亡，可能是本身基底細(xì)胞凋亡；而Pb和DP單獨(dú)暴露組斑馬魚尾部發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡(P < 0.01)。但是與Pb單獨(dú)暴露相比，Pb和DP聯(lián)合暴露減少了斑馬魚尾部的細(xì)胞凋亡，且在較低濃度聯(lián)合暴露組(5 μg·L-1Pb + 15 μg·L-1DP)呈現(xiàn)顯著性差異(P < 0.05)。

2.4 DP對(duì)斑馬魚體內(nèi)Pb蓄積含量的影響

斑馬魚胚胎分別用5 μg·L-1Pb和20 μg·L-1Pb單獨(dú)染毒至120 hpf時(shí)，體內(nèi)Pb蓄積含量依次為(1 127.5 ± 173.6) ng·g-1和(2 259.8 ± 101.0) ng·g-1。Pb和DP聯(lián)合染毒時(shí)，DP并未顯著影響斑馬魚體內(nèi)Pb的吸收(圖4)。

2.5 Pb對(duì)斑馬魚體內(nèi)DP蓄積含量的影響

斑馬魚經(jīng)15 μg·L-1DP和60 μg·L-1DP單獨(dú)染毒至120 hpf時(shí)，體內(nèi)DP蓄積量分別為(772.4 ± 31.6) ng·g-1和(2 127.7 ± 52.6) ng·g-1。如圖5所示，5、20 μg·L-1Pb分別與60 μg·L-1DP聯(lián)合暴露，斑馬魚體內(nèi)的DP蓄積水平分別顯著下降了14.2%和29.3%。與15 μg·L-1DP單獨(dú)暴露相比，低濃度聯(lián)合暴露(15 μg·L-1DP + 20 μg·L-1Pb)也顯著降低斑馬魚體內(nèi)的DP蓄積含量(P < 0.05)。同時(shí)，Pb和DP聯(lián)合染毒均促進(jìn)斑馬魚體內(nèi)anti-DP的轉(zhuǎn)化。

圖2 Pb和DP對(duì)斑馬魚初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)抑制注：+(P < 0.05), ++(P < 0.01)表示相同Pb濃度下，Pb單獨(dú)暴露組和 與DP聯(lián)合暴露組呈現(xiàn)顯著差異，*(P < 0.05), ** (P < 0.01) 表示Pb單獨(dú)暴露組和對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異。Fig. 2 Inhibitory effect of co-exposure to Pb and DP on axonal growth of primary motoneuron in zebrafishNote: +(P < 0.05), ++(P < 0.01) indicate significant differences between Pb exposure alone and co-exposure to DP at the same concentration of Pb, *(P < 0.05), ** (P < 0.01) indicate significant differences between Pb treatment and controls.

圖3 Pb和DP對(duì)斑馬魚尾部細(xì)胞凋亡的影響注：+(P < 0.05), ++(P < 0.01)表示相同Pb濃度下，Pb單獨(dú)暴露組和 與DP聯(lián)合暴露組呈現(xiàn)顯著差異，*(P < 0.05), ** (P < 0.01) 表示Pb單獨(dú)暴露組和對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異。Fig. 3 Effects of co-exposure to Pb and DP on cell apoptosis in the tail region of zebrafishNote: +(P < 0.05), ++(P < 0.01) indicate significant differences between Pb exposure alone and co-exposure to DP at the same concentration of Pb, * (P < 0.05), ** (P < 0.01) indicate significant differences between Pb treatment and controls.

圖4 不同濃度的DP對(duì)斑馬魚體內(nèi)Pb蓄積水平的影響Fig. 4 Effect of different concentration of DP on bioaccumulation of Pb in zebrafish

3 討論(Discussion)

本研究表明Pb和DP單獨(dú)暴露均顯著增加斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)頻率，降低觸摸反應(yīng)能力和自由游泳活力，二者聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)、觸摸反應(yīng)能力和自由游泳活力的影響均存在交互作用且為拮抗效應(yīng)(P < 0.05)。此外，Pb顯著降低斑馬魚體內(nèi)DP的吸收，且促進(jìn)anti-DP在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)化。

DP具有高親脂疏水性(LogKow; 9.3)，需以DMSO作為助溶劑。本研究中DP染毒劑量明顯高于環(huán)境水體中的含量[30](< 10 ng·L-1)。但是為短期暴露條件下獲得較明顯的生物學(xué)效應(yīng)，以探索其潛在的作用機(jī)制，通常會(huì)采用較高的染毒劑量[23]。本研究斑馬魚體內(nèi)DP含量(550.5～2 127.7 ng.g-1)和Wu等[7]報(bào)道貴嶼電子垃圾拆解區(qū)水生生物體中DP的含量(19～9 630 ng.g-1)相當(dāng)。Pb染毒濃度則明顯低于貴嶼電子垃圾拆解區(qū)水體中Pb的含量[31](< 400 μg·L-1)，且斑馬魚體內(nèi)Pb蓄積水平(1 127.5～2 340.5 ng.g-1)和Qiu等[32]報(bào)道魚體中Pb含量水平(< 2 700 ng·g-1)相當(dāng)。這說明本研究所選用的DP和Pb染毒劑量均為環(huán)境相關(guān)濃度。

Pb單獨(dú)暴露增加斑馬魚自主運(yùn)動(dòng)頻率，降低觸摸反應(yīng)能力、自由泳動(dòng)活力以及對(duì)光暗周期刺激的游泳速率，這說明Pb暴露對(duì)斑馬魚產(chǎn)生明顯的神經(jīng)行為毒性。本研究中Pb暴露濃度(≤ 20 μg·L-1)和環(huán)境污水中Pb濃度相當(dāng)，表明Pb對(duì)環(huán)境中魚類也會(huì)引發(fā)神經(jīng)行為毒性。斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為異常與毒物影響其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)，阻礙樹突和軸突之間的信號(hào)傳遞有關(guān)。初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是一類斑馬魚胚胎早期發(fā)育中支配其運(yùn)動(dòng)行為的細(xì)胞。本研究中Pb暴露明顯抑制斑馬魚初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)，并且加劇尾部肌肉細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為異常。此外，甲狀腺激素能夠影響神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)的發(fā)育，Zhu等[24]研究顯示Pb會(huì)降低斑馬魚體內(nèi)甲狀腺素水平，因而推測(cè)這是Pb引起斑馬魚神經(jīng)行為毒性的另一個(gè)誘因。

與Pb相似，DP單獨(dú)暴露也導(dǎo)致斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為異常，抑制初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)，加劇尾部細(xì)胞凋亡，這表明DP也具有神經(jīng)行為毒性，但其作用機(jī)制目前并不清楚。乙酰膽堿酯酶和Ca2+信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和神經(jīng)細(xì)胞功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，已有研究報(bào)道DP能夠影響蚯蚓乙酰膽堿酯酶的活性[20]及其細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路[33]，然而，DP暴露對(duì)斑馬魚是否也有此效應(yīng)，還需進(jìn)一步深入研究。

Pb和DP單獨(dú)暴露均會(huì)引起斑馬魚神經(jīng)行為毒性，但Pb和DP對(duì)斑馬魚神經(jīng)行為的聯(lián)合毒性為拮抗作用，這與二者聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的影響相一致。此外，斑馬魚體內(nèi)DP蓄積含量顯示，Pb的加入明顯降低斑馬魚體內(nèi)DP的吸收，因而推測(cè)Pb和DP拮抗效應(yīng)的產(chǎn)生與二者在體內(nèi)的代謝相互影響有關(guān)。一方面可能是Pb激活機(jī)體對(duì)DP脫毒代謝相關(guān)酶的活性，加速DP代謝和轉(zhuǎn)化，從而減弱毒性效應(yīng)；另一方面可能是DP影響金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，加速金屬硫蛋白對(duì)游離Pb的螯合作用，從而削弱Pb的毒性。此外，Zhang等[34]報(bào)道anti-DP極易穿過血腦屏障在魚的大腦中富集，這暗示anti-DP更易引起斑馬魚神經(jīng)行為毒性。本研究Pb的引入可以明顯促進(jìn)斑馬魚體內(nèi)anti-DP的轉(zhuǎn)化，這也進(jìn)一步說明Pb和DP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚神經(jīng)行為毒性表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

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NeurotoxicEffectsofCo-exposuretoLeadandDechloranePlusonZebrafish(Daniorerio)Embryos

Chen Xiangping1, Huang Changjiang2, Chen Yuanhong2, Liu Bin3, Liu Cuiping3, Zhu Yaxian4, Zhang Yong1,*

1. State Key Laboratory of Marine Environmental Science of China (Xiamen University), College of the Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361102, China2. College of Public Health and Management, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China3. Wenzhou Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Wenzhou 325027, China4. Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China

10.7524/AJE.1673-5897.20161109001

2016-11-09錄用日期2016-12-17

1673-5897(2017)3-309-08

X171.5

A

張勇(1962—)，男，博士，教授、博導(dǎo)，主要研究方向環(huán)境科學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文近200篇。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21577110)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20130121130005)

陳香平(1985-)，女，博士研究生，研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: pxc850222@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yzhang@xmu.edu.cn

陳香平, 黃長(zhǎng)江, 陳元紅, 等. 鉛和得克隆聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)毒性作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 309-316

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