植物-微生物修復石油烴污染土壤與根際微生態環境變化

孔德康，王紅旗,*，劉自力，許潔，熊櫻

1. 北京師范大學水科學研究院，北京 1008752. 北京京誠嘉宇環境科技有限公司，北京 100176

植物-微生物修復石油烴污染土壤與根際微生態環境變化

孔德康1，王紅旗1,*，劉自力1，許潔1，熊櫻2

1. 北京師范大學水科學研究院，北京 1008752. 北京京誠嘉宇環境科技有限公司，北京 100176

石油烴作為一類持久性難降解有機污染物對土壤環境質量產生嚴重的危害。以天津大港油田原油污染土壤中篩選出的耐低溫高效石油烴降解菌為靶細胞，以小麥、紫花苜蓿作為供試植物，利用盆栽試驗，對植物-外源菌協同修復體系中的脫氫酶活性和土壤微生物多樣性進行研究，分析其變化及其與石油烴降解率的關系。結果表明植物-微生物協同修復對石油烴具有較好的降解能力，其中小麥-固定化外源菌組具有最高的降解率，石油烴含量從最初的30 600 mgkg-1下降為24 300 mgkg-1，降解率為20.6%，并且其試驗后期石油烴的降解率最大，遠遠高于其他時期，表現出良好的修復潛力。外源菌投加的初始階段會迅速提高脫氫酶活性，然而這種影響隨著降解時間延長而逐漸減弱。初期脫氫酶活性與總石油烴的降解存在較好的相關性，脫氫酶活性可以在一定程度上表征土壤石油烴的降解情況。微生物多樣性與總石油烴降解也存在一定的相關性。

石油烴；植物-外源菌協同修復；脫氫酶活性；微生物多樣性

Received11 January 2017accepted28 May 2017

Abstract: Petroleum hydrocarbons are persistent refractory organic pollutants and have negative effect on soil environmental quality. The plant-bacteria combined method has been extensively investigated to remediate petroleum hydrocarbon contaminated soils in recent years for its high efficiency and safety. The bacteria that has low temperature-resistance and high efficiency for petroleum hydrocarbon degradation, were screened from crude oil contaminated soil in Dagang oil field of Tianjin, and selected as target cells. Wheat and alfalfa were used as target plants, and pot experiments were applied to study the dehydrogenase activity and soil microbial biodiversity. The results showed that petroleum hydrocarbons were reduced the most in wheat-bacteria remediation group with degradation rate of 20.6%. The degradation rate at final stage was much higher than that of other periods. The dehydrogenase activity was rapidly increased in the initial stage when exogenous bacteria was added, while this activity was gradually reduced with time. Dehydrogenase activity was related to the degradation of total petroleum hydrocarbons and it can be used to characterize the degradation of petroleum hydrocarbons in soils. There is a good correlation between the microbial biodiversity and the degradation of total petroleum hydrocarbons.

Keywords: petroleum hydrocarbons; plant-microbe combined remediation; dehydrogenase activity; microbial biodiversity

目前，植物-微生物的協同修復已是石油烴污染土壤生物修復領域中的研究熱點。利用微生物和植物自身的特性，以及它們之間的協同作用對污染土壤進行修復，能夠有效減少生物修復石油烴污染土壤的時間，極大提高修復效率[1]。植物-微生物協同修復石油烴污染土壤，主要是依靠植物的根系和根系分泌物共同促進土壤微生物的生長和繁殖[2]。Xu等[3]研究發現了Kocuria sp. P10和黑麥草的協同修復極大提高了多環芳烴(PAHs)的去除率，在75 d內對PAHs的去除率達到了69.6%。Tejeda-Agredano等[4]研究發現太陽花的種植使得微生物降解PAHs的效率提高了16%。

根際微生態環境包括了根際土壤的pH、溫度、酶、微生物群落等，它們對土壤中石油烴的降解存在著重要意義[5-8]。土壤酶是參與土壤新陳代謝的重要物質，土壤中參與多環芳烴降解的酶主要是加氧酶、脫氫酶、磷酸酶和木質素酶等[9]。有研究表明，多酚氧化酶活性在種植植物的土壤中要顯著高于不種植物的土壤，并且它們的活性變化趨勢與石油烴降解菌的數量有關[10]。Wang等[11]發現植物根系分泌的低分子有機酸(LMWOAs)增強了土壤中脫氫酶的活性，并且LMWOAs和脫氫酶能夠促進土壤對PAHs的去除。脫氫酶在環狀有機化合物的分解轉化過程中起著重要的作用，在多數情況下植物根系及微生物對石油污染物的降解都是從脫氫開始。因此，可以利用脫氫酶的活性反映植物-微生物系統降解石油烴的活性。土壤微生物群落特征可以直接展示環境體系生態功能特性，可用于評估生物修復土壤的效果。張宇寧等[12]采用Biolog分析理化因子如總氮、總磷、速效磷、pH、總有機碳等與土壤微生物群落碳代謝特性的關系。除此之外，Biolog還可以應用于石油烴降解菌的鑒定工作[13-14]。

本文以天津大港油田原油污染土壤中篩選出的耐低溫高效石油烴降解菌為靶細胞，選取小麥、紫花苜蓿作為供試植物，構建植物-外源菌協同修復體系，對協同修復體系中的脫氫酶和微生物多樣性進行研究，分析其變化及其與石油烴降解的相關關系。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

本次試驗供試土壤為北京市昌平區沙河某玉米地中的清潔農田土壤。采集耕作層(20 cm)土壤樣品，去除植物殘體及大顆粒礫石后混合，風干過2 mm篩備用。通過人為投加污染物的形式，選取質量分數為3%的石油烴濃度作為試驗濃度，將原油與清潔農田土壤按比例均勻混合后靜置于4 ℃條件下30 d。原油樣品采自天津大港油田某采油井。本次試驗的供試植物為小麥、紫花苜蓿，高效降解菌DG17從天津大港油田原油污染土壤中篩選而出。試驗開始前，測定土壤的理化性質、含水率等指標(表1)。控制初始的土壤含水率在30%左右。

表1 土壤理化性質(mgkg-1)Table 1 Some physical and chemical properties of tested soils (mgkg-1)

表1 土壤理化性質(mgkg-1)Table 1 Some physical and chemical properties of tested soils (mgkg-1)

指標IndexesCHNPK褐土Cinnamon462909070640583．4318606

1.2 試驗設計

分別設置不同的試驗條件，如表2所示，在試驗室可控條件下進行盆栽試驗，采用6個設計4個平行。選用白色陶土盆，直徑為25 cm，高25 cm。每個盆中裝入石油污染土壤2 500 g(石油烴的質量分數為3%)。小麥種子和苜蓿種子經過消毒處理后，播種在土壤中。模擬北方區的自然氣候條件，試驗條件設置為20 ℃、12 h光照，10 ℃、12 h黑暗，試驗設計進行10周。為避免高濃度石油污染土壤對于小麥、紫花苜蓿的發芽抑制作用，本試驗擇在接種外源微生物后將浸泡至已微露白芽的小麥與苜蓿種子播種至土壤中，1周后種子陸續發芽。

分別于播種后第7天、第21天、第42天、第56天、第70天采集土壤樣品。取樣采用滅菌的抹刀，

表2 試驗條件設計Table 2 Experimental condition design

小心去除表層土壤，然后取下圓柱型的土體。輕輕抖落植物根系附著的表土，小心收集根周圍土壤，取20 g土壤樣品放在冷凍干燥機中，冷凍干燥48 h，以進行后續的石油烴含量測定和酶活性測定的試驗。試驗初期(第0天)和試驗進行70 d后分別采集土壤樣品進行微生物生物多樣性分析。

1.3 測試項目及方法

總石油烴的提取和測定采用快速溶劑萃取+重量法，溶劑選用正己烷∶丙酮=1∶1(V/V)，分別稱取6 g硅藻土和10 g凍干處理的土壤樣品，放入干凈研缽中充分混合、研磨，然后裝入33 mL萃取池中進行快速溶劑萃取。采用收集瓶對萃取完成的樣品進行收集，放在通風櫥中，經氮吹掃，用分析天平稱取收集瓶前后的質量差，3次恒重后計算總石油烴的質量。

2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(TTC)作為氫的受體，會在土壤中脫氫酶的作用下形成紅色的三苯基甲臜(TPF)，兩者在一定范圍內呈線性關系，因此使用比色法測定其形成量作為土壤脫氫酶的活性指標。

稱取相當于10 g風干土的新鮮土壤樣品，盛于裝有100 mL滅菌水的三角瓶中，250 rmin-1振蕩1 h，靜置15 min，按10倍系列梯度稀釋制備土壤懸液。用自動多頭移液器移取土壤提取液，吸取稀釋10-3之后的樣品，接種至微孔平板中。30 ℃培養，分別在培養后的1、2、3、4、7、10 d用Biolog自動讀數裝置在590 nm分析[15]。采用Biolog微孔平板孔中的吸光度值分別計算平均顏色變化率(AWCD)，土壤微生物群落功能多樣性指數(Shannon指數(H))，代謝剖面反應孔的數目代表微生物群落的豐富度(S)。

1.4 數據處理

為定量動態描述石油烴的抑制作用，采用活性抑制率予以表征，負值表示激活作用，正值表示抑制作用。計算公式如下：

脫氫酶活性抑制率= (1-A/A0) ×100%

式中，A為試驗組脫氫酶活性，A0為對照組脫氫酶活性[16]。

采用Excel2016和Origin9.0制圖，采用SPSS19.0進行相關性分析。

2 結果與討論(Results and discussions)

2.1 石油烴的降解量

試驗結束后，根據各組實驗第7、21、42、56、70天的石油烴含量，對各組不同時段的降解率進行了計算，結果如圖1所示。

整個試驗階段，種植小麥+固定化外源菌(A)對石油污染土壤有較好的修復效果，計算整個70 d降解率為20.59%。其次是紫花苜蓿+固定化外源菌的協同修復體系(B)以及只投加固定化外源菌(E)，降解率分別為18.35%和18.04%。種植紫花苜蓿(D)去除率為16.88%，對土著菌降解石油烴有較好的促進作用，而種植小麥(C)的降解率為14.05%，對于土著菌的促進作用并不大，這可能與小麥的生長周期以及試驗條件有關。對不同組別的降解率進行單因素方差分析，只有C組與對照組的差異不顯著，表明單獨種植小麥的效果不明顯，同時A組相較于其他各組，具有較顯著差異。

圖1 不同處理條件下不同時段石油烴(TPH)的降解率注：A小麥+固定化菌劑，B苜蓿+固定化菌劑，C小麥， D苜蓿，E接種固定化菌劑，F原狀土。Fig. 1 Degradation rate of total petroleum hydrocarbons (TPH) in different tests during each periodNote: A Wheat + Immobilized bacteria, B Alfalfa + Immobilized bacteria, C Wheat, D Alfalfa, E Immobilized bacteria, F Soil.

試驗溫度控制在20 ℃、12 h光照，10 ℃、12 h黑暗情況下，植物生長較為緩慢。本試驗條件下，小麥經過3周的出苗期之后未進入自然狀況下的越冬期，相比于自然狀態下的小麥莖稈較為纖細。另一方面，小麥根系對于石油烴污染較為敏感，試驗過程中發現小麥的生長情況不如正常條件。而當小麥和固定化外源菌同時存在時，一方面，小麥的根際環境可能使得固定化顆粒中包含的外源菌DG17得以緩慢釋放，相比于只接種固定化外源菌而言，與土著微生物的融合有一個緩沖過程，而且具有更長久的作用效果；另一方面，外源菌的緩慢釋放也增加了對石油烴的降解，有效減緩污染物對于小麥根系的脅迫作用，能夠更好地保護小麥的根系。

另外，觀察各組試驗后期(56～70 d)的降解率，不難發現A組和B組有較高的后期降解率，分別為11.3%和6.5%，C組、D組和E組次之，分別為1.1%、1.1%和1.7%，F組后期降解率幾乎為0。可以預言，如果試驗繼續進行，植物-微生物協同修復組的降解效率會更高。

2.2 根際微生態環境的變化

2.2.1 脫氫酶活性變化

分別對不同處理條件下，不同采樣時間的土壤樣品進行處理，分析其脫氫酶活性隨時間的變化規律，如圖2所示。

由圖2可知，除了接種固定化菌劑外，脫氫酶活性在整個試驗過程中都經歷先升高后下降的趨勢。其中，A組脫氫酶活性上升幅度最大，經歷14 d(7 d至21 d)的降解后從初始的35.124 μg TPFg-1干土上升至55.822 μg TPFg-1干土，提高了0.59倍。如表3所示，整個試驗中脫氫酶活性抑制率在-187%到52%之間，其中只接種固定化菌劑的土壤在第7天時酶活性抑制率最小，為-187%；小麥-固定化菌劑協同修復組污染土壤42 d時抑制率最大，為52%。

在種植植物的條件下，從第7天到第21天土壤脫氫酶活性都有較大的提高。其中，21 d時小麥、紫花苜蓿與固定化外源菌協同修復體系中脫氫酶活性比7 d時分別增加了20.698 μg TPFg-1干土、15.189 μg TPFg-1干土；在只種植小麥或紫花苜蓿，不接種外源菌的條件下，21 d時脫氫酶活性也比7 d時分別提高了12.092 μg TPFg-1干土、10.507 μg TPFg-1干土。清潔土壤中添加石油烴污染物時，土壤的脫氫酶活性會發生顯著的變化。有研究發現，以柴油為污染物進行模擬試驗，發現被污染后土壤熒光素雙醋酸酯(FDA)、脫氫酶及過氧化氫酶活性均立即增加[17]；而也有研究表明，中等程度的石油烴污染(4 000～8 000 mgkg-1)能明顯抑制脫氫酶活性[18]。原油污染土壤中本身存在大量的土著微生物能夠降解石油烴，當供試土壤置于適宜的環境條件下，土著菌開始發揮作用，能夠在一定程度上利用石油烴作為碳源。因此，試驗初期，土壤即具有一定的脫氫酶活性。

表3 植物-微生物修復石油烴污染土壤時脫氫酶活性抑制率Table 3 The inhibition rate of dehydrogenase activities during plant-microbial remediation of TPHs impacted soils

注：A小麥+固定化菌劑，B苜蓿+固定化菌劑，C小麥，D苜蓿，E接種固定化菌劑，F原狀土。

Note: A Wheat + Immobilized bacteria, B Alfalfa + Immobilized bacteria, C Wheat, D Alfalfa, E Immobilized bacteria, F Soil.

種植植物的條件下，土壤脫氫酶活性能夠有一定程度的提高，許多研究者在試驗過程中也證實了這一點：例如王靖等[19]研究發現150 d的盆栽實驗中，鋪地黍、牛筋草和百絲3種草不同程度地加快了土壤中石油污染物的降解，與未種植植物土壤相比，土壤中脫氫酶的活性高出0.61～1.20倍。

由此可見，在土壤的脫氫酶活性變化過程中，植物起著非常重要的作用，外源菌的投加初始階段會迅速提高脫氫酶活性，然而這種影響隨著降解時間而逐漸減弱。當植物和外源菌同時存在條件下，植物對于土壤酶活性的影響起著主要作用。

2.2.2 生物多樣性的變化

本研究分別選取了24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h、240 h的總平均光密度(AWCD)值進行比較。對于初始樣品，在240 h培養期間，AWCD從24 h開始迅速提高，168 h左右達到穩定狀態，本研究選擇光密度指數增加時期72 h的光密度用于統計分析。對于70 d后的土壤樣品，在240 h培養期間，AWCD從24 h開始迅速提高，240 h左右達到穩定狀態，本研究選擇光密度指數增加時期96 h的光密度用于統計分析。選取了表征微生物群落多樣性最常見的多樣性指數(H)、碳源利用豐富度指數(S)，以AWCD的變化來表征微生物群落結構的變化。通常認為，多樣性高的群落，對環境中不同資源利用得更充分，抗外界擾動的能力更高[20]。

如表4所示，由多樣性指數H、豐富度指數S和平均顏色變化率AWCD可以看出，初始的土壤樣品所有的處理組均高于對照組(F)，種植植物以及接種外源菌處理都能夠不同程度的提高微生物的多樣性，然而影響幅度并不大。

如圖5所示，分別對不同處理樣品初期的多樣性以及70 d之后的結果進行比較，發現小麥-固定化菌劑處理組、小麥處理組以及對照組的多樣性指數與平均吸光度值較初期有所增加，而其余處理組的多樣性指數、平均吸光度值均有不同程度的下降。總體而言，不同處理體系的微生物群落多樣性之間差異較小，后期的土壤與初期土壤相比，多樣性變化并不顯著。有研究表明，土壤微生物群落代謝多樣性可能受土壤條件如土壤類型、含水率、總碳、總氮以及植物根系成熟度等多種因素的影響[21-23]。

表4 初始土壤微生物群落多樣性指數和72 h總平均光密度(AWCD)Table 4 Diversity indices for initial soil microbial communities and average well color development (AWCD) of 72 h

注：A小麥+固定化菌劑，B苜蓿+固定化菌劑，C小麥，D苜蓿，E接種固定化菌劑，F原狀土。

Note: A Wheat + Immobilized bacteria, B Alfalfa + Immobilized bacteria, C Wheat, D Alfalfa, E Immobilized bacteria, F Soil.

表5 降解70 d后土壤微生物群落多樣性指數和96 h AWCDTable 5 Diversity indices for soil microbial communities and AWCD of 96 h after 70 d degradation

注：A小麥+固定化菌劑，B苜蓿+固定化菌劑，C小麥，D苜蓿，E接種固定化菌劑，F原狀土。

Note: A Wheat + Immobilized bacteria, B Alfalfa + Immobilized bacteria, C Wheat, D Alfalfa, E Immobilized bacteria, F Soil.

另一方面，土壤中石油烴也可能影響微生物群落結構。通常認為，石油烴會刺激土壤中的微生物的生長，使得利用石油烴為碳源的微生物成為優勢菌群，從而增加石油烴降解菌的數量，同時其毒害作用會抑制其他微生物的生長而降低微生物群落的多樣性；然而也有研究發現石油污染土壤微生物群落功能的多樣性高于無污染的土壤，并且在一定范圍內隨著石油污染程度的升高，微生物群落的豐富度、優勢度以及均勻度均升高。

表6 試驗初期(0 d)石油烴降解量與環境微生態要素的相關分析Table 6 Relationship between the removal amount of oil hydrocarbons and the micro-ecological environment factor (on 0 d)

注：**在0.01水平(雙側)上顯著相關，*在0.05水平(雙側)上顯著相關。

Note: ** significant correlation at the 0.01 level (bilateral), * significant correlation at the 0.05 level (bilateral).

本試驗條件下，土壤的初始條件基本保持相同，外界的干擾主要來自植物以及外源菌的投加。土壤微生物功能多樣性在試驗初期與試驗后期并沒有呈現顯著的差異。結合石油烴的降解情況分析，小麥-固定化外源菌協同修復體系具有良好的石油烴降解效果可能源于接種外源菌并種植小麥的條件下，微生物物種多樣性以及碳源利用的豐富度均有所提高。多樣性指數是微生物代謝多樣性的一個表征，需要進一步分析微生物對不同碳源的利用情況進而了解微生物群落結構的動態變化。

2.3 根系生態環境與石油烴去除率間的相互關系

研究表明微生物降解石油烴的機制一方面可能是微生物分泌表面活性劑，例如鼠李糖脂等，對石油烴進行增溶和分散，增加石油烴的比表面積，從而利于微生物與石油烴接觸，加速石油烴的降解[24]。另一方面，在石油烴的微生物降解過程中，微生物分泌的酶可能對石油烴的降解起重要的催化作用，例如石油烴降解過程中，脫氫酶能夠促進石油烴活化氫原子而實現石油烴的氧化。脫氫酶活性與石油污染物中石油烴衰減量有良好的相關性，并且可以作為微生物對底物適應性的指標[25]。本文對試驗初期土壤脫氫酶活性、物種多樣性指數、碳源利用豐富度指數、AWCD與土壤石油烴降解量進行相關性分析，見表6。

許多研究者認為，土壤脫氫酶活性是反映微生物降解石油烴效率的重要指標，并且脫氫酶活性變化過程與石油烴的降解存在正相關關系。本文研究發現，在整個石油烴的降解過程中，土壤脫氫酶活性發生了一定的波動。初期脫氫酶活性與總石油烴的降解呈顯著正相關(P<0.05)。因此，脫氫酶活性可以在一定程度上表征土壤石油烴的降解情況。

同時根據表6，我們發現石油烴降解與碳源利用豐富度指數呈顯著相關(P<0.05)，與物種多樣性呈正相關，雖然未達到顯著水平，但相關系數達到了0.715，與AWCD的相關系數也達到了0.626。說明石油烴降解量與土壤中微生物多樣性有著一定的關系。

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◆

RemediationofPetroleumHydrocarbonContaminatedSoilbyPlant-MicrobeandtheChangeofRhizosphereMicroenvironment

Kong Dekang1, Wang Hongqi1,*, Liu Zili1, Xu Jie1, Xiong Ying2

1. College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China2. Beijing Jing Cheng Jia Yu Environmental Technology Co. Ltd., Beijing 100176, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170111001

2017-01-11錄用日期2017-05-28

1673-5897(2017)3-644-08

X171.5

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王紅旗(1960-)，男，浙江義烏人，博士。北京師范大學水科學研究院水生態與環境研究所所長、教授、博士生導師。主要從事污染土壤/地下水修復機理與修復技術、環境評價規劃與管理、場地污染修復與地下水污染風險評價、可持續發展與環境教育等方向的科研與教學工作。主持國家科技支撐計劃項目、“863計劃”項目、國家基金項目、國家專項項目等重大項目與課題30余項，發表學術論文150余篇，撰寫和合寫專著15余部、教材30余部。

國家自然科學基金“包氣帶微生物跨膜運輸多環芳烴的動態過程及膜蛋白功能調控研究”(41772234)；國家自然科學基金“包氣帶微生物對多環芳烴的跨膜運輸及膜蛋白傳輸方式的研究”(41372232)

孔德康(1993-)，男，碩士研究生，研究方向為多環芳烴污染土壤生物修復，E-mail: 505682192@qq.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: whongqi@126.com

孔德康, 王紅旗, 劉自力, 等. 植物-微生物修復石油烴污染土壤與根際微生態環境變化[J]. 生態毒理學報，2017, 12(3): 644-651

Kong D K, Wang H Q, Liu Z L, et al. Remediation of petroleum hydrocarbon contaminated soil by plant-microbe and the change of rhizosphere microenvironment [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 644-651 (in Chinese)