一株瑞士乳桿菌的分離鑒定及其產VB12的影響因素研究

王順陽+郝燕+王洪斌+王海+張勝楠

摘要：對市售的乳酸飲品的乳酸菌進行了分離純化，得到菌株HYWZ-6，結合16S rRNA基因序列分析，確定為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），并以溫度、NaCl、膽鹽、pH及檸檬酸三鈉作為影響因素，對其產VB12進行研究，并利用酶聯(lián)免疫分析法對該菌在不同因素條件下培養(yǎng)100 h后產VB12的含量進行測定。結果表明，HYWZ-6菌株在不同條件下產VB12的差異性較大，35 ℃ VB12的含量最高，25 ℃最低，35 ℃時含量比25 ℃時高出175.2%；NaCl質量分數(shù)與VB12的含量呈反比，NaCl質量分數(shù)為1%時VB12含量最高，7%時最低，相差224.4%；膽鹽質量分數(shù)為0.1%時VB12含量達到最高；pH為4時VB12含量最高，在pH為7時VB12含量最低，前者是后者的5.8倍；檸檬酸三鈉質量分數(shù)為2.5%時VB12的產量最高，比最低產量高出143.2%。

關鍵詞：瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）；分離鑒定；VB12；影響因素

中圖分類號：Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3238-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.012

Isolation and Identification of a Lactobacillus helveticus and Research on the Effect Elements of VB12 Produced by It

WANG Shun-yang1， HAO Yan2， WANG Hong-bin2， WANG Hai2， ZHANG Sheng-nan2

（1.Marine College， Shandong University （Weihai）， Weihai 264209， Shandong， China；

2.Marine Resources Development Institute of Jiangsu， Lianyungang 222005， Jiangsu， China）

Abstract： A bacterial strain called HYWZ-6 was isolated and purified from lactic acid drink，being available in the market， combined with 16S rRNA sequence analysis，it was identified as Lactobacillus helveticus. The influencing factors of VB12 produced by HYWZ-6，such as temperature，NaCl，cholate，pH and trisodium citrate were studied，and the content of VB12 was measured by VB12 enzyme immunoassay after the bacterial strains had been cultivated under different circumstances for 100 hours. The results showed that the bacterial strain HYWZ-6s situation on producing VB12 under different circumstances had relatively huge differences，the content of VB12 would reach maximum at the temperature of 35 ℃，and it would reach the minimum at the temperature of 25 ℃，the discrepancy was 175.2%. The concentration of NaCl was inverse proportion to the content of VB12. When NaCl was 1%，the content of VB12 would reach maximum； when the NaCl was 7%，it would reach the minimum，the discrepancy was 224.4%. The content of VB12 would reach the maximum when cholate was 0.1%. The content of VB12 would reach the maximum when pH was 4，and it would reach the minimum when pH was 7，the former was 5.8 times as much as the latter. The output of VB12 was most when the trisodium citrate was 2.5%，the discrepancy between the highest yield and the lowest yield was 143.2%.

Key words： Lactobacillus helveticus； isolation and identificationm； VB12； influencing factor

存在于有機體內的乳酸菌具有強大的生態(tài)功效，它不僅能夠加快有機體的生長速度、調節(jié)胃腸道中的正常菌群數(shù)、維持有機體內的微生態(tài)系統(tǒng)平衡，還能極大地改善和提高胃腸道功能；另外，還能大幅提升食物消化率和生物效價；有效降低血清膽固醇的含量，很好地控制內毒素的水平；有效抑制胃腸道內腐敗細菌生長繁殖，增強機體免疫系統(tǒng)功能等[1，2]。與此同時，乳酸菌在工業(yè)、農業(yè)、食品和醫(yī)藥等與日常生活緊密相關的重要領域也有著廣泛的應用前景。多數(shù)乳酸菌早已因為其特殊的益生作用越來越頻繁地出現(xiàn)于醫(yī)療和養(yǎng)生領域，譬如發(fā)酵酸奶、作為微生態(tài)制劑用于胃腸道和用于制作乳酸飲品等[3-5]。endprint

由于大多數(shù)益生菌是經口服而在消化道中發(fā)揮作用，所以益生菌不僅要對動物消化道環(huán)境具有強大的耐受性，保持一定數(shù)量的活菌數(shù)，而且，它的代謝產物要參與消化功能的調節(jié)，影響固有免疫和適應性免疫[6]。近年來，人們對乳酸菌代謝產物提取的研究予以前所未有的重視。研究表明一些乳酸菌具有產VB12的特性，乳酸菌產VB12可避免有些菌株在生產過程中產生的毒素和不良物質等[7]。本研究對市售的乳酸飲品的乳酸菌進行了分離純化，結合16S rRNA基因序列分析，最終確定為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），并對其產VB12的影響因素進行了探討，旨在為深入研究該菌株對人類機體免疫功能潛力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 HYWZ-6從乳酸飲品（連云港東農乳業(yè)）中分離得到。

1.1.2 緩沖液與常用試劑 基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K、Taq酶、PCR試劑、DNA Marker、溶菌酶等購自寶生物工程（大連）有限公司；VB12 ELISA KIT購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 ①牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min；②MRS培養(yǎng)基[8]。大豆蛋白胨 10.0 g，C6H12O6 20.0 g，牛肉膏10.0 g，吐溫-80 1.0 g，酵母粉5.0 g，K2HPO4 2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三鈉 2.0 g，MgSO4 0.2 g，MnSO4 0.054 g，去離子水1 000 mL，瓊脂粉20.0 g，pH 6.5， 121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 乳酸菌的分離純化 取適量乳酸樣品接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng) 48 h，適量菌液用滅菌生理鹽水依次稀釋為10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，充分混勻，選取10-4、10-5和10-6 3個稀釋梯度的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置，37 ℃培養(yǎng)48 h。純化得到1株優(yōu)勢菌，命名為HYWZ-6，接種到MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌株標記，4 ℃保存[9]。

1.2.3 HYWZ-6基因組DNA提取及16S rRNA擴增 HYWZ-6基因組DNA提取采用試劑盒提取；以HYWZ-6基因組DNA為模板，以27F：5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACC TTGTTACGACGACTT-3′[10]為引物進行16S rRNA PCR擴增。PCR體系為去離子水39 μL，Buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，模板樣液1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，Taq酶 1 μL。PCR程序為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)。瓊脂糖電泳檢測PCR產物，PCR產物送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序，序列登錄GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，用鄰接法構建進化樹并分析確定其種屬[11]。

1.2.4 樣品處理及VB12檢測 HYWZ-6接種于MRS液體培養(yǎng)基，混合均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，操作2次，活化菌株。按質量分數(shù)為2%的菌種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)100 h，使其代謝產物的積累達到極值，再將磷酸氫二鈉1.3 g、亞硫酸氫鈉1.0 g、檸檬酸1.2 g用100 mL去離子水溶解，取目的培養(yǎng)液5 mL，用10 mL上述溶液混合后，再用去離子水定容至150 mL，置于121 ℃下水解10 min，冷卻后用HCl調節(jié)pH至4.5，再用去離子水按比例稀釋1 000倍，即為待測樣品[12]。VB12標準曲線制作及VB12含量的酶聯(lián)免疫檢測依據(jù)VB12 ELISA KIT（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）說明書操作。

1.2.5 HYWZ-6產VB12影響因素的研究 0.5 mL的供試菌液分別接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，混合均勻，分別置于25、30、35、40、45 ℃的水浴鍋中水浴0.5 h，取出后37 ℃培養(yǎng)100 h，使其代謝產物的積累達到極值，用酶聯(lián)免疫分析法于450 nm波長下對不同溫度下的吸光度（OD）進行測定，制作標準曲線后根據(jù)樣品中VB12的OD計算樣品中VB12的濃度，以分析不同溫度對VB12產量的影響。

參照上述方法，分別設置1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的NaCl質量分數(shù)/（m/V）梯度；0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和1.0%的膽鹽質量分數(shù)/（m/V）梯度；3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH梯度；0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的檸檬酸三鈉質量分數(shù)/（m/V）梯度。酶聯(lián)免疫分析法檢測HYWZ-6菌株產VB12的含量。

2 結果與分析

2.1 HYWZ-6菌株基因組DNA及16S rRNA擴增結果

對HYWZ-6菌株基因組DNA及16S rRNA進行PCR擴增，由圖1可以看出，提取的基因組DNA純度較高、完整性也較好，能夠滿足后續(xù)試驗的要求。

由圖2可知，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條清晰的條帶，特異性較強，純化后進行測序。

2.2 16S rRNA的測序結果及進化樹構建

據(jù)上海桑尼生物科技有限公司16S rRNA的測序結果，圖4為MEGR5.0軟件用鄰接法建立起來的HYWZ-6菌株系統(tǒng)進化樹，經分析確定該菌株為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。endprint

2.3 HYWZ-6菌株產VB12的影響因素

2.3.1 VB12濃度標準曲線的繪制 采用酶聯(lián)免疫分析法制作的VB12濃度標準曲線如圖4所示，R2為0.994 2，相關性較強。

2.3.2 溫度對HYWZ-6菌株產VB12的影響 不同溫度影響試驗菌株產VB12的結果見圖5。在不同溫度下HYWZ-6菌株都能產生一定量的VB12，但在35 ℃下VB12的產量最高，25 ℃下VB12的產量最低。35 ℃時的產量比25 ℃時的產量高出175.2%。

2.3.3 NaCl對HYWZ-6菌株產VB12的影響 不同NaCl質量分數(shù)影響試驗菌株產VB12的結果見圖6。由圖6可知，NaCl質量分數(shù)與VB12的產量呈反比，NaCl質量分數(shù)為1%時VB12的產量最高，NaCl質量分數(shù)為7%時VB12的產量最低，最高產量比最低產量高出224.4%。

2.3.4 膽鹽對HYWZ-6菌株產VB12的影響 不同膽鹽質量分數(shù)影響試驗菌株產VB12的結果見圖7。在不同膽鹽質量分數(shù)下VB12的產量都較高，但在0.2%時VB12的產量略微偏低，在0.1%時VB12的產量達到最高，VB12的最高產量比最低產量高173.6%。

2.3.5 pH對HYWZ-6菌株產VB12的影響 不同pH影響試驗菌株產VB12的結果見圖8。由圖8可見，不同pH對試驗菌株產VB12的影響較為明顯，在pH為4時VB12的產量達到最高，在pH為3和5時VB12的產量較高，在pH為6、7、8時VB12的產量均較低。總體上，VB12的最高產量是最低產量的5.8倍。

2.3.6 檸檬酸三鈉對HYWZ-6菌株產VB12的影響

不同質量分數(shù)的檸檬酸三鈉影響試驗菌株產VB12的結果見圖14。試驗菌株在不同質量分數(shù)檸檬酸三鈉下的VB12產量均較高，但當檸檬酸三鈉加到一定量時，VB12的產量可達到最大。檸檬酸三鈉質量分數(shù)為2.5%時的產量最高，比最低產量高出143.2%。

3 討論

乳酸菌是目前食品工業(yè)領域前途廣闊的微生物之一，一旦人們對于這類菌種的作用機理和生長規(guī)律有了較為深切的了解，將有助于拓展乳酸菌的應用范圍，這一點會為人類食品的多樣化做出應有的貢獻[13]。

本研究對市售的小樣乳酸飲品的乳酸菌進行了分離純化，純化后的瑞士乳桿菌的菌落形狀近似圓形，直徑約為2～3 mm，不透明，呈白色或淺灰色。瑞士乳桿菌具有較好的耐熱性，能夠生存的溫度范圍較廣，一般為15～45 ℃，最佳的生活溫度在42 ℃[11]。本研究分離得到的HYWZ-6菌株能耐受60 ℃的高溫，耐熱性比預期更強（結果未顯示）。

研究表明，人體胃液中的酸堿度會隨著飲食結構的調整而上下浮動，正常情形下的pH大概在3.0左右，人不吃東西或者是吃了較酸的食物之后，胃液的酸性會變得更強，pH可下降到1.5，吃了堿性較高的食物之后，胃液的pH也能夠上升到4.0～5.0，而食物在胃中通過的時間只有1～2 h[14]。由此可見，益生乳酸菌的耐酸堿性強度是決定其發(fā)揮生理功能的關鍵因素。該試驗菌株在不同pH下均有一定的生長量，但在pH為7～8時菌株的生長量有極大提高，此外，在pH為4時VB12的產量可達到最高。綜上所述，瑞士乳桿菌有一定的耐酸性，在偏中性的環(huán)境中生長較好，可用于制作乳制飲料，發(fā)揮其特有的生理功能。

瑞士乳桿菌是一種常見的乳酸菌，主要用于干酪、酸乳等發(fā)酵乳制品的生產。有研究表明，瑞士乳桿菌與其他微生物聯(lián)用，用于水產動物的免疫調節(jié)及水質改善[15]。近年來，關于瑞士乳桿菌在發(fā)酵乳制品方面的研究越來越廣泛，因為瑞士乳桿菌的細胞壁蛋白酶可以水解乳蛋白產生血管緊張素轉移酶抑制肽（ACE抑制肽），能有效降低血壓[13]。然而，關于瑞士乳桿菌產VB12的研究鮮見報道。本研究對分離到的瑞士乳桿菌（HYWZ-6菌株）產VB12的益生性能作了初步研究，重點探討了該菌產VB12的影響因素，結果顯示瑞士乳桿菌可以作為益生菌株以開發(fā)新的益生菌制品。

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