ADME——當前殺蟲劑研發的主要關注點

姚光凱，趙 晨，陳鈴詩，徐漢虹編譯

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ADME——當前殺蟲劑研發的主要關注點

姚光凱1，趙 晨1，陳鈴詩2，徐漢虹1編譯

(1.華南農業大學 天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣州 510642；2.華南農業大學圖書館，廣州 510642)

關于藥物吸收、分布、代謝、排泄(Absorption/ distribution/mentabolism/excretion，簡稱ADME)的研究已成為藥物化學研究中必不可少的部分，也是農藥的研發與登記中相當重要的環節。當前農藥研發主要關注對非靶標生物(如哺乳動物、魚、益蟲和作物等)的毒性以及土壤和水中的轉運與代謝。在研究成本持續增長的情況下，各農藥公司仍然進行了大量相關研究，并在構效關系模型的構建方面積累了豐厚的經驗。然而在醫藥產業中，關于藥物的ADME在非靶標生物體和環境中的種種問題與該產業以人為主的研究重心之間，依然存在著矛盾。

在醫藥領域，一旦確認了一個重要的市場需求或疾病，就需要根據病理生理學知識、已知的分子作用機制和相關化學研究來選擇有價值的治療靶標。根據初期假設所提出的藥物進入途徑、分子靶標位點進行研究，往往具有較大的風險。通常，關于ADME的研究會被部署于藥物開發階段，因為如果要使已經投入應用的藥物同時滿足靶點和ADME的要求，需要復雜的化學改造過程。另外，制藥公司將現有的醫藥發現模型轉化成有效的人類藥物的過程中，將面臨許多困難，因為在臨床試驗前，研發者不能對人體進行測試。這就要求研發者在病理生物化學，藥物的理化性質和ADME特性上進行深入的了解。即便如此，將藥物最終商業化的進程也往往非常困難及昂貴。

通常，在農藥研發初期，農藥公司針對化合物對有害生物的活性進行廣泛的測試。這一手段相比醫藥研發模式具有一定優勢，其篩選過程可以直接針對研發目標的作用對象(有害生物)，所有的害蟲靶標均存在于篩選過程中，而且能夠通過初步篩選的化合物也已經具有克服各種ADME障礙的性質。此外，只要化合物能獲得良好的殺蟲活性和非靶標生物安全性，對其靶標的確認并不重要。但是，不同于醫藥行業，農藥的經濟價值在于盡可能降低生產成本，因而經濟、高產的合成工藝十分重要。這一要求很大程度上限制了同時滿足與靶點的結合力和ADME要求的小分子結構的可選范圍。此外，一個成功農藥(特別是殺菌劑和殺蟲劑)在多種作物上的生物利用度參數十分復雜，將實驗室得到的成果轉化至大田環境往往非常困難。

然而，即使受到環境的復雜性和農藥成本的約束，為什么仍然要在農藥研發階段對生物利用度及ADME進行相關研究，而不是完全依靠生物活性篩選結果來優化先導化合物呢？因為在化合物結構優化過程中，對活性化合物作用機制的解讀同樣重要，而活性篩選僅能為此提供粗略的信息。

人們應該意識到，ADME及生物利用度的相關問題常常會在研發過程中導致高經濟風險及不確定性，從而限制先導研究的發展(生物活性優化)，針對作用機理的研究可以幫助解決這些問題。盡管具有殺蟲活性的先導化合物在被篩選出的過程中已經克服了ADME的若干障礙，但仍不具備商品化農藥的活性水平、殺蟲譜及選擇性。因而，公司在ADME特性研究上應該投入相應的資源和人力，并且聯合化學家、害蟲生物學家和靶點生物化學家，共同確定解決問題的辦法。這些先導化合物可能出現的問題有：⑴對靶點作用強，但是對有害生物活性差；⑵具有高殺蟲活性，但對非靶標生物毒性大，無法登記；⑶對某種害蟲具有很好的殺蟲活性，但是對相近目或種類害蟲活性低甚至無活性；⑷在作物中傳導性差，持效期較短，不足以殺死害蟲，或不能達到商業利益最大化。

因此，農藥研發是否成功，很大程度上取決于一個研發機構能否快速應用ADME及靶點知識來解決問題，從而經濟高效地構建和執行項目。

本文將從毒理學角度討論3個殺蟲劑的研發歷程。每個實例都描述了ADME如何與作用靶點、靶標生物方面的研究成果相結合，為解決研發過程中的關鍵問題提供思路與方法。這些實例中，先導化合物的特性均得到了最優化，并最終成功商品化。ADME技術如能持續發展，得到合理應用，其在未來的農藥研發及先導化合物優化中將扮演重要的角色。

1 內吸性的改進：從氯蟲苯甲酰胺到溴氰蟲酰胺

鄰甲酰胺基苯甲酰胺類殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺是杜邦(DuPont)公司近年來大力推廣的產品，其設計靈感來源于日本Nihon Nohyaku公司的產品氟苯蟲酰胺。這2種化合物均主要作用于昆蟲魚尼丁受體。這類殺蟲劑的發現引致現代農藥化學、靶標認知以及害蟲防治的革命。

在明確了氯蟲苯甲酰胺對咀嚼式口器害蟲的防效之后，從20世紀90年代末到21世紀初，美國杜邦公司進行了對刺吸式口器害蟲具有防效的鄰甲酰胺基苯甲酰胺系列衍生物的研發。研發團隊認為，如果要提高該類化合物在作物體內的內吸性，除了通過降低化合物值，還要同時開展改造后的化合物在作物體內的滲透與內吸性試驗。于是，合成化學家擁有了化合物對刺吸式口器害蟲的活性、通過HPLC-MS和生物測定得到的化合物在植物體內經由木質部和韌皮部的轉運情況、物理性質等大數據，設計化合物要平衡多個優化因素。在淘汰了若干具有優異內吸性但活性較差的化合物之后，該團隊最終通過將氯蟲苯甲酰胺結構中苯環上的氯原子替換成氰基(圖1)，成功獲得了活性優異的化合物溴氰蟲酰胺。該化合物在植物體內的木質部輸導性及葉面滲透性明顯增強，對蚜蟲、葉蟬與稻飛虱、粉虱、鞘翅目害蟲和雙翅目害蟲的生物活性顯著提高，同時也保持了該類化合物對鱗翅目害蟲優異的殺蟲活性。溴氰蟲酰胺在植物體內的轉運情況及研究方法已有深入的報道。該研究同時也發現，溴氰蟲酰胺是一種強力的魚尼丁受體激活劑，其效果與氯蟲苯甲酰胺相當。

本例通過一個簡單的結構改造就顯著提升了化合物在作物中內吸性與葉面滲透性，對刺吸式口器害蟲的毒性增加。因此，ADME相關研究結合大數據分析，在溴氰蟲酰胺的發現過程中發揮了很大的作用。

圖1 鄰甲酰胺基苯甲酰胺類殺蟲劑結構式

2 二氫吡唑類化合物茚蟲威的高效低毒化設計

20世紀70至80年代，荷蘭Philips-Duphar公司首次報道一類含二氫吡唑類結構殺蟲劑，隨后Rohm-Haas公司也發表了相關化合物研究文章及專利。這類結構中的一些化合物體現出了優異的殺蟲活性。Vincent Salgado博士在研究中認為這些化合物是類似于局部麻醉劑的鈉離子門控通道阻斷劑，這一觀點隨后被通過神經細胞的22Na+吸收和電壓鉗試驗所證實。20世紀80至90年代，又有幾類基于酰胺骨架結構的二氫吡唑類殺蟲劑被發現并獲得專利。然而，此類殺蟲劑的工業化進程發展十分緩慢，原因不是由于化合物本身的殺蟲活性不高，而是因為它們可持續存在于哺乳動物體內，并伴有緩慢、積累性的神經毒性，且在環境中降解緩慢。杜邦作物保護公司意識到這一問題后，針對問題的解決方案以及殺蟲活性的進一步提升，對該類化合物展開了進一步的研究。

1990年，Keith Wing博士加入了美國杜邦作物保護公司，組織了一支集合多名優秀化學家和生物學家的團隊，首次開展了對鈉離子通道阻斷殺蟲劑(sodium channel blocker insecticide，簡稱SCBI)候選化合物在哺乳動物體外與體內代謝情況的測定。關于SCBI的化學研究始于二氫吡唑結構衍生物，之后擴展到氧化吲唑類、吲唑類、縮氨基脲、吡唑啉類、噠嗪類、三嗪類和噁二嗪類結構。團隊針對該類化合物對鱗翅目害蟲的生物活性、哺乳動物代謝和環境殘留的情況，對化合物結構進行了優化。為確保項目平穩進行，團隊中的合成化學家、生物化學家和生物學家時刻保持密切交流，從而能對整個系列的化合物均進行深入了解。最終，團隊發現了一種活性優異、在哺乳動物體外及體內具有良好代謝能力、環境易降解的噁二嗪類候選化合物，命名為茚蟲威(圖2)。該化合物在昆蟲體內經-去甲氧基羰基代謝酶代謝，降解成具有殺蟲活性的昆蟲鈉離子通道阻斷劑DCJW(DPX-JW062的-去甲氧基羰基代謝物；當前體農藥是含有對應異構體的DPX-MP062時，其活性代謝物是DCMP)。在哺乳動物體內，茚蟲威通常可被降解，表現出與其他大多SCBI類化合物不同的安全特性。近年來，日本Nihon Noyaku、德國巴斯夫(BASF)和美國輝瑞動物安全部開發了另一個SCBI類殺蟲劑氰氟蟲腙。

杜邦公司成功開發SCBI類殺蟲劑的歷程給了人們重要的啟示。首先，通過團隊合作交流，結合多方試驗結果來設計并優化先導化合物，確定農藥在環境中的代謝途徑，能夠解決長期困擾農藥產業的若干問題。第二，組織團隊成員進行定期交流，便于整個團隊對殺蟲活性、環境降解及代謝穩定性等信息達成深入的了解，以及組員對新思路或新化合物進行迅速的嘗試。第三，在茚蟲威這個項目中，團隊同時針對噁二嗪核心骨架(通過對SCBI系列化合物進行大量篩選而確定的)及側鏈取代基進行修飾，為研發工作提供了大量在哺乳動物體內可降解性、殺蟲活性方面各不相同的化合物。代謝性質優越的SCBI類殺蟲劑開發成功，得益于整個團隊對以上幾點的良好實施，這也需要團隊耐心和有條理的工作，對先導研究結果進行深入的理解。

3 二芳酰肼類昆蟲生長調節劑的發現：蛻皮激素激動劑的ADME特性是決定其殺蟲活性的關鍵因素

Rohm-Haas公司的二芳酰肼類蛻皮激素(dibenzoylhydrazine ecdysone，簡稱DBH)受體激動劑研發歷程非常獨特，為后來農藥研發與應用提供了寶貴的經驗。Keith Wing博士和Glenn Carlson 博士曾經與哈佛大學生物實驗室的Carroll Williams 教授(昆蟲生理學之父)以及他團隊中昆蟲發育/分子生物學家Louis Safranek博士、Peter和Lucy Cherbas開展過密切合作。在此期間，Keith Wing博士認為昆蟲蛻皮激素的生理途徑是一種潛在的殺蟲劑靶標，并于20世紀80年代早期開展了相應的研究。

與此同時，Adam Hsu博士在合成一類含單苯甲酰結構的化合物過程中，通過對一種含二芳酰肼結構的副產物進一步純化以及生物活性測試，意外地成功合成出第一個蛻皮激素類活性化合物。二芳酰肼類化合物是一種與眾不同的昆蟲生長調節劑(insect growth regulator，簡稱IGR)，可以導致鱗翅目幼蟲口器畸形。一些猜測認為該類化合物作用方式與雙酰基脲類IGR(如滅幼脲)一樣，但Keith Wing博士在將酰肼類化合物作用于4齡至5齡的煙草天蛾()幼蟲后，意外發現其能迅速導致幼蟲異常蛻皮，且生效時間明顯早于雙酰基脲類化合物。在與Williams教授團隊的合作下，Keith Wing博士于1984年至1987年期間，在Rohm-Haas公司實驗室針對這一現象進行了一系列后續試驗，并有一些新的發現。

圖2 Phillips-DuPhar公司吡唑啉和杜邦公司噁二嗪類殺蟲劑結構式

首先，在果蠅Kc細胞系中，叔丁基DBH RH 5849作為3H-尖葉土杉甾酮A與蛻皮激素受體結合的直接競爭者，與蛻皮激素的生理反應相同。在抗DBH細胞系與蛻皮激素抗性細胞系對兩類化合物都存在交互抗性。在代謝和轉運機制并不是影響因素的試驗中發現，無論從哪方面來看，RH 5849的作用與昆蟲蛻皮激素20-羥基蛻皮酮相同，但其活性只有后者的1/100。

第二，正常煙草天蛾()幼蟲和腹部被結扎的幼蟲用RH 5849處理，均能引起過早蛻皮，且其活性比20-羥基蛻皮酮高幾個數量級，特別是在經口飼喂的情況下(DBH類化合物經皮吸收活性稍弱)。結果發現，煙草天蛾幼蟲經口飼喂14C-RH 5849后，化合物在血液中的濃度在7 h時達到最高，甚至45 h后仍能保持毒理學殘留的顯著水平。與此相對應的是，在正常幼蟲中，20-羥基蛻皮酮濃度在幼蟲發育中期時達到最大，之后在幼蟲正常蛻皮之前被代謝酶降解至不可檢測水平。由此推斷，RH 5849在昆蟲體內的殘留水平能夠導致幼蟲早熟蛻皮，從而在發育完備前強迫蛻皮，且在形成新表皮之后仍無法蛻皮完全。另外，由于殘留的RH 5849對中樞神經內分泌系統的影響，正常的神經激素(如促前胸腺激素和促蛻皮激素)級聯反應信號必然會受到擾亂。此外，蛻皮激素放射免疫分析表明，RH 5849處理能強烈抑制內源20-羥基蛻皮酮的峰值。這不僅排除了RH 5849系列化合物的作用機制是誘導蛻皮激素分泌，而且證明了該類化合物對幼蟲大腦和前胸腺中樞神經內分泌反射區具有強烈的抑制作用。

研究結果還顯示，DBH系列衍生物與果蠅Kc細胞系受體間的親合力與衍生物刺激煙草天蛾幼蟲過早蛻皮的能力密切相關，而且這些DBH衍生物在鱗翅目幼蟲體內具有相似的ADME性質。因此，該類化合物對印度谷螟和黃瓜甲蟲細胞系的相關試驗得以開展，以期能擴寬該類化合物的殺蟲譜。作者在Rohm-Haas公司完成了所有的細胞系和受體準備以及昆蟲活性篩選的工作，由此驗證化合物的構效關系。此項研究中，這支由合成化學家、生物化學家與生物學家所組成的團隊共同設計并成功商業化了三個具有較高受體親和力和殺蟲活性的化合物：蟲酰肼和甲氧蟲酰肼(主要防治鱗翅目害蟲)、氯蟲酰肼(主要防治鞘翅目害蟲)(圖3)。由于成功研發了蟲酰肼等對非靶標生物安全、對環境友好的殺蟲劑，Rohm-Haas公司于1998年獲得了美國總統綠色化學挑戰獎。隨后，另外兩個具有相同作用機制的化合物被日本曹達/三井公司以及江蘇省農藥研究所成功商品化。

圖3 蛻皮激素激動劑代表性化合物結構式

此外，對DBH類化合物作用機制的揭示，明顯提升了以下2個領域的研究力度：⑴農藥公司對可作用于蛻皮激素受體的其他化合物的相關研究；⑵對DBH和天然蛻皮激素在受體上的結合位點，以及與其他種類昆蟲蛻皮激素受體相關的分子生物學基礎研究。

果蠅蛻皮激素受體(EcR)于1991年首次被成功克隆。隨后，試驗證明了蛻皮激素受體首先需要和超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)形成二聚體，進而與蛻皮激素激動劑結合形成復合體，轉錄激活下游蛻皮激素響應元件。在接下來的幾年里，許多其他目的昆蟲蛻皮激素受體和超氣門蛋白被克隆和表達。由于蛻皮激素受體和超氣門蛋白結合的特性，極大引起了人們對此類靶點相關研究的熱度，分子生物學家和生物化學家據此構建多種無細胞和細胞系高通量篩選平臺。

最后，在研究中也發現了其他能與EcR/USP復合體結合并選擇性轉錄的化合物類型。關于此類研究領域，目前已有文獻進行全面的綜述。雖然尋找高效的DBH化學替代品非常困難，對控制農業害蟲、無脊椎動物傳病媒介的持續需求將維持本領域研究的不斷進行。由于此類化合物的作用靶標僅存在于無脊椎動物中，因而從機理上保證了對哺乳動物的安全性。

另外一個由蛻皮激素激動劑/DBH相關研究帶來的好處是，基于此類基因模式調控系統，可以根據需要設計出具有特異性的配體/基因開關組合，從而實現對特定多肽或蛋白的過表達，最終用于人類健康方面的研究。這一設想最初是在Rohm-Hass公司進行DBH殺蟲劑研究時提出的，也因此導致子公司Rheogene的建立。在這種情況下，藥物ADME的概念也被應用于一系列作為基因開關的配體結構的設計。這項技術最終轉讓給匹茲堡大學藥學院，并被合成生物學公司Intrexon收購。當前，Intrexon公司正在與Ziopharm Oncology公司、Merck Serono公司與M.D. Anderson 癌癥中心合作，共同應用基因開關技術，選擇性地激發白介素-12的表達，用于對黑素瘤、乳腺癌和神經膠質瘤的控制。該研究不僅獲得了良好的預期效果，還計劃將成果推廣于其他疾病的防治。研究人員開創了這項技術在農業領域的初期發展，也希望它對人類健康能有潛在的使用價值。因而，這項技術能在治療人類重大疾病方面占據一席之地，讓研究者倍感欣慰。

整個發現歷程具有一定意外性，歸功于研究成員細致的觀察、對偶發時機的把握以及良好的相互協作。研究始于一個活性低但意義重大的天然甾醇蛻皮激素類似物，其獨特的ADME特性使其能長時間存在于昆蟲體內，破壞多種依賴于蛻皮激素的機能。通過對先導化合物進一步優化，所得到的衍生物在昆蟲尤其是鱗翅目昆蟲體內，與蛻皮激素受體的結合能力得到了顯著的提升。在此基礎上，許多研究者得以針對雙翅目、同翅目、鞘翅目昆蟲中以及其他類型的蛻皮激素受體尋找具有結合能力強的化合物。整個研發歷程很好地示例了，針對作用靶標的研究是如何結合對關鍵ADME性質的理解、對昆蟲生理學和害蟲生物學的認知，共同指導合成化學走向全新的領域，協助先導化合物的優化，找到最理想的化合物。最后，Keith Wing博士認為，可能還有其他相對長效的激素激動劑或者神經遞質(如優于新煙堿類殺蟲劑)類似物有待被發現，并且成為活性優異的殺蟲劑先導化合物。

4 結 論

殺蟲劑的滲透/分布/代謝/分泌(ADME)性能是當前許多研究的主題。本文結合了幾種前體農藥的研發過程，為農藥研發機構提供了一個重要的工作基礎，也為正在面臨ADME難題的公司指明了選擇方向。

本文中的實例顯示，深入表征先導研究中的ADME特性和靶點，采用協作方式解決問題，是在農藥及藥物研發中取得進展的關鍵。只有聯合具有不同背景的團隊成員，共同設計試驗方案并分享數據及想法，才能將先導研究成功轉化為研發進展、農藥登記，甚至能在化合物商業化后繼續給予支持。

最后，一支農藥研發團隊需要全面的多學科背景與技術支持，才能在優化先導化合物過程中具有創造性、發散性的思維，提高解決問題的能力，并在最大限度上提升投資收益和減少不必要的開銷。只有在這樣的團隊里，才能使化學家在探索密切相關的衍生物或者其他相關藥效基團、創建多樣化的結構活性模型的過程中，確保研究對象符合不同生物水平的要求。盡管當前各個行業均關注研發成本，但正由于追求這種具有高風險意識、審慎且高效的工作方式，本文所介紹的團隊與技術能夠在獲得收益的同時，對農藥科學的內涵得到更深入的理解。這對于21世紀現代農藥發展有著極為重要的意義，因為在這一階段的新產品，通常要求在具有內吸性的同時，可適用于多種應用方式，并能接受多種成分的混配。因此，結合對農藥應具備的理化性質的關注以及對植物吸收、轉運和代謝過程的認識，對設計滿足現代農藥標準的新農藥具有持續性的指導意義。在過去的10年里，一系列具有優異的輸導性和高活性的農藥得到登記，表明了這些策略已經在一些農藥公司中得以實施。

希望本文能促進農藥研發中創造性思維的發展，并為此類研究探索提供一些長遠的思路。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.04.02

TQ450

A

1009-6485(2017)04-00011-05

姚光凱(1987—)，男，博士研究生，研究方向：導向農藥合成。

徐漢虹(1961—)，男，教授，博士生導師，研究方向：植物源農藥，導向農藥及其作用機制。

2017-07-30。