食源性糖蛋白分離純化的研究進展

趙文竹，張宏玲，陳月皎，于志鵬，*，張瑞雪，劉靜波，勵建榮，*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學營養與功能食品研究室，吉林長春130062）

食源性糖蛋白分離純化的研究進展

趙文竹1，張宏玲1，陳月皎1，于志鵬1，*，張瑞雪1，劉靜波2，勵建榮1，*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學營養與功能食品研究室，吉林長春130062）

糖蛋白是由寡糖鏈與蛋白質共價相連構成的復合糖，具有多種生物活性，糖蛋白的分離純化與糖蛋白結構解析和功能分析的研究有著密不可分的關系。對糖蛋白的分離純化方法進行綜述，并對未來糖蛋白的分離純化進行展望，旨在探索糖蛋白的高效分離純化方法，為糖蛋白的深入研究提供理論依據。

糖蛋白；分離；純化；結構鑒定

Abstract：Glycoprotein is a glycoconjugate in which a protein carries one or more carbohydrate chains covalently attached to its polypeptide backbone.Glycoprotein has emerged as an important class of bioactive natural products extracted from natural resources.The purification of glycoprotein has intimate relation with the research of glycoprotein structure and function analysis.Reviewing the methods of purification of glycoprotein，in addition，the further study of purification of glycoprotein was addressed to find a novel approach for purification of glycoprotein，aiming to provide a theory basis for furthering research of glycoprotein.

Key words：glycoprotein；separation；purification；identification

糖蛋白是一種結合蛋白，是寡糖鏈與多肽以多種形式共價相連且具有生物活性的物質，兼具多糖和蛋白質的功能性質。糖蛋白是蛋白質翻譯后修飾的產物，蛋白質的許多生理功能均可以通過糖基化來實現[1]。糖蛋白具有抗氧化[2]，抗老年癡呆[3]，抗炎癥[4]，免疫調節[5]等生物活性，生物活性與糖鏈有著密不可分的關系，如糖脂糖鏈對血型、大腦及神經組織的生命活動有決定作用[6]。糖鏈結構對于糖蛋白功能活性有著直接的影響，高純度的糖基化蛋白是結構解析的首要步驟，因此，糖蛋白的分離純化是結構分析和功能性分析的前提基礎[1]。糖蛋白的純化是指除去粗糖蛋白中的雜質，獲得單一糖蛋白組分的過程，對于糖蛋白的分離純化主要是參考蛋白質和多糖的分離純化方法[7]，由于其糖鏈結構的復雜性和多樣性，糖蛋白的分離純化在一定程度上增加了難度，因此純化的方法尤為重要。本文對目前常用的糖蛋白分離純化方法進行介紹。

1 色譜法

色譜法是糖蛋白分離純化研究中一種常用手段，其應用已較為成熟[8-17]，主要為離子交換色譜法、凝膠色譜法和凝集素親和色譜法。

1.1 離子交換色譜法

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術相結合，通過固定相上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換而達到分離的目的，主要用于分離離子或可解離化合物[18]。Braga等[19]將掌葉蘋婆種子純化組分用0.025 mol/L Tris-HCL緩沖液洗脫，將500 μL樣品裝樣到離子交換柱上進行純化，對純化后的凝集素進行檢測，其分子量為17 kDa，并對熱和酸穩定，且有抗氧化活性、抗菌活性和低溶血性。Wang等[20]用DEAE-52 celloulus陰離子交換柱層析對大蒜糖蛋白進行純化，用苯酚-硫酸法、凝膠滲透色譜法和SDS-PAGE電泳法對糖蛋白組分進行檢測，證明糖蛋白是同一種糖蛋白且組分純度較高。Senthilkumar等[21]通過Q-Sepharose陰離子交換柱層析對綠色海藻進行純化，用考馬斯亮藍染色（CBB）和碘酸雪夫氏染色（PAS）對SDS-PAGE電泳進行染色，對純化得到的糖蛋白的化學成分、等電點、構象、蛋白質類型、抗癌活性進行分析，表明經純化得到了一種新型的糖蛋白。

1.2 凝膠色譜法

凝膠色譜的分離機理類似于分子篩效應，按照分子尺寸與凝膠孔徑大小之間的相對關系來進行分離，溶質流出凝膠的速率取決于分子的大小和凝膠的阻礙作用。Su等[22]對黃海馬糖蛋白（HG）進行純化，將經過DEAE-52陰離子交換柱層析純化得到的兩個組分HG-1和HG-2，用Sephadex G-100凝膠柱層析進行進一步純化，進一步純化后的HG-1和HG-2組分分別在20 min～115 min和15 min～75 min檢測發現為均一的糖蛋白組分，且糖含量分別為56.7975%和39.479%，蛋白質含量分別為30.547 5%和51.747%。Dai等[23]對虎斑烏賊肌肉糖蛋白（SPMG）進行純化，經DEAE-52陰離子交換柱層析純化得到了兩個組分SPMG-A和SPMG-B，SPMG-A組分糖蛋白含量較少且難收集，將SPMG-B組分作為主要的研究對象，用Sephadex G-100凝膠柱層析對SPMG-B進行進一步的純化，得到兩個均一的糖蛋白組分SPMG-Ⅰ和SPMG-Ⅱ。Yang等[24]對銀杏核糖蛋白進行純化，將經過DEAE-52陰離子交換柱層析純化后分析得到的Ⅰ組分進行Sephadex G-200凝膠柱層析純化，分析發現凝膠柱層析后的5組分是均一的銀杏核糖蛋白組分。

1.3 凝集素親和層析

凝集素親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力來進行純化的技術。對于一些如酶、蛋白、抗體、核酸等生物大分子和帶電性質相似，分子大小相近的糖鏈，親和色譜的選擇性最高。凝集素是一類蛋白質或是糖蛋白[1]，由于凝集素能識別、結合特定單糖或糖鏈結構的糖蛋白，因而凝集素親和層析是分離純化糖蛋白時最有效的工具[25]。常用的凝集素有伴刀豆凝集素（ConA）和麥胚凝集素（WGA）等，ConA能特異結合α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基。不同糖蛋白的伴刀豆凝集素（ConA）和麥胚凝集素（WGA）的結合部位與雜環硼酸酯的反應流程如圖1所示[26]，ConA能特異結合在C3、C4和C6有自由羥基的糖蛋白的甘露糖和葡萄糖殘基上，硼酸共價結合甘露糖、半乳糖和葡萄糖，WGA能結合含有末端N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸或者殼二糖的低聚糖。

圖1 不同N-糖鏈結構的凝集素結合部位與雜環硼酸酯的反應Fig.1 The binding motifs for the lectins of different N-glycan structures and the reaction scheme for the formation of the heterocyclic boronic acid diester

王艷等[27]在分離純化玉竹糖蛋白時，通過ConA親和層析，將經Sephadex G-100凝膠過濾的粗糖蛋白進一步純化，得到兩種糖蛋白PDG1和PDG3，其分子量分別為186 kD和28.3 kD，且具有一定抗氧化能力。Jana等[28]利用ConA親和層析分離純化出核糖核酸酶B及辣根過氧化物酶，用MALDI-MS對含有0.2 mol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷溶液進行洗脫的洗脫液和洗滌液進行測定，結果證明糖蛋白純化效果很好。Lee等[29]用Con A-Sepharose 4B分離純化梔子花糖蛋白并進行洗脫，得到分子量為27 kDa的糖蛋白。

2 膜分離法

膜分離作為一種新型的分離技術，具有收率高、耗能低的特點，還極少破壞被純化物質的生物活性，適用于熱敏性物質（多糖、蛋白質等）等活性物質的分離純化[30]，包括超濾、納濾等[31]。膜分離法在蛋白質分離純化中的應用較多，對于糖蛋白的分離純化應用的還較少，膜分離法是根據膜的孔徑大小對不同分子量物質進行截留，但只能達到粗略地對糖蛋白進行分級的目的，要想進一步純化，還要結合色譜法或者電泳法。劉棟[32]在制備甘薯糖蛋白的過程中，將膜分離技術與Sephadex G-150結合使用，分離純化得到了兩種組分，并且具有抗突變和抗腫瘤活性。

超濾是利用膜的選擇性，將膜兩側的壓力差作為推動力，根據溶液中各個組分與孔徑大小之間的關系，導致通過膜的遷移速率不同，進而實現分級分離[33-34]。超濾技術具有不會發生相變、耗能低、在常溫下可操作等特點。使用超濾對產品進行純化，提高純度的同時，還可節約試劑的使用量，且由于分離純化的連續性，可以縮短生產的周期。任國艷等[35]采用多步分離純化，通過超濾濃縮、分級沉淀、陰離子交換柱層析和凝膠柱層析對海蜇頭糖蛋白分離純化后，得到組成均一的JGP-Ⅲ糖蛋白，其中既有O-糖肽鍵，又有N-糖肽鍵。

納濾與超濾相同，是利用膜兩側的能量差作為推動力，根據組分與孔徑大小間的關系實現分級分離[30，33]。納濾是介于反滲透和超濾之間的一種壓力驅動型膜分離技術，納濾膜的截留分子量為150 u～1 000 u[30]。納濾技術不需加熱，不發生相變，沒有化學反應的發生，不破壞生物活性，不改變風味，節能，分離效率高，污染小，被廣泛地應用于食品中的分離純化等過程[30]。

透析是利用小分子經過半透膜擴散到水溶液的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術，透析常用于除去小分子物質。范勇等[36]將Sephadex G-100凝膠過濾柱層析和DEAE-52纖維素柱層析分離純化得到的兩種巨大型蒲公英糖蛋白組分，用透析法純化得到巨大型蒲公英小分子量糖蛋白。

3 電泳法

電泳是利用分子大小、形狀、負載電荷不同的糖蛋白在電場作用下遷移速率不同而達到分離的方法。常用的分離純化方法有凝膠電泳和毛細管電泳等。

在糖蛋白的研究中，與其它分離技術相比，凝膠電泳可以同時分離多個復雜混合物，凝膠電泳常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳常用于蛋白質的分離，無法分離大分子的糖蛋白；而瓊脂糖凝膠孔徑大，致使小分子糖蛋白直接透過，因此對小分子糖蛋白達不到篩選的效果或者效果不明顯，主要用于分離大分子的DNA。程玉祥[37]對茶樹葉糖蛋白進行了純化研究，利用SDS-PAGE凝膠電泳和ConA-sapharose親和層析對茶樹葉糖蛋白進行純化，對在SDS膠上快速純化的糖蛋白用被動擴散的方式進行回收，結果表明回收率為50%。

毛細管電泳是以毛細管為分離通道、以高壓電場為驅動力，依據樣品中各組分帶電粒子在毛細管溶液中遷移速度不同而實現分離的一類液相分離技術。毛細管電泳具有簡單、高效、快速、微量、易于自動化、一機多用和環境污染少等特點，廣泛應用于分離多種化合物。陳義[38]以聚丙烯酰胺涂層毛細管為分離通道對雞卵白蛋白分離出25個以上的峰，使轉鐵蛋白分離出10個左右的峰。目前，電泳多用于分離后的純度鑒定和分子量的確定。

4 展望

目前，糖蛋白分離純化的方法大多是沿用蛋白質的方法，對于糖蛋白的分離純化應用較多且較為成熟的還是凝膠色譜法和離子交換色譜法，凝集素親和色譜也時常用到。由于糖蛋白具有微觀不均一性，結構復雜多樣，致其測定較為困難，糖蛋白的分離純化與糖蛋白的結構有著密不可分的關系，找到更好的分離純化糖蛋白的方法對于糖蛋白結構的分析也有一定的幫助。糖蛋白的復雜性，可能致使使用單一的純化方法，不能達到理想的純化效果，在未來糖蛋白的分離純化中，可以從以下幾方面進行：一是沿用現有較為成熟的色譜法之外，將目前的方法相結合，如將膜分離法與電泳法等結合使用；二是將更多分離純化蛋白質或多糖的方法應用在糖蛋白中，與分離純化糖蛋白的成熟方法相比較，以期找到更有效的分離純化方法，為糖蛋白的分離純化提供新思路，也為糖蛋白的進一步研究提供良好的基礎。

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Progress on the Purification of the Food-derived Glycoproteins

ZHAO Wen-zhu1，ZHANG Hong-ling1，CHEN Yue-jiao1，YU Zhi-peng1，*，ZHANG Rui-xue1，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

2017-02-25

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.040

國家自然科學基金項目（31601479）；渤海大學博士啟動項目（0515bs020）

趙文竹（1986—），女（漢），講師，博士，研究方向：植物活性成分研究。

*通信作者：于志鵬（1984—），男，講師，博士，研究方向：蛋白質及活性肽；勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向：水產品加工。