QuEChERS超高效液相色譜串聯質譜法測定堅果中38種農藥殘留

董亞蕾 劉文婧 曹進 王鋼力

摘要建立了檢測4種堅果（花生、杏仁、腰果、核桃）中38種農藥殘留的QuEChERS超高效液相色譜串聯質譜（UPLCMS/MS）方法。樣品均質后，用乙腈進行提取，經PSA和C18凈化后，采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進一步凈化， UPLCMS/MS分析。對樣品前處理和色譜方法進行了優化。在多重反應監測（MRM）模式下進行質譜分析，外標法定量。38種農藥的檢出限范圍（S/N=3）為0.01～10 μg/kg，定量限（S/N=10）為0.05～20 μg/kg，線性關系良好（r>0.991）。4種堅果中農藥的平均加標回收率為51.0%～126.0%，相對標準偏差均小于20%。此方法靈敏、準確、有效，可用于堅果類食品中多種農藥殘留的同時測定。

關鍵詞超高效液相色譜串聯質譜； QuEChERS； 農藥殘留； 堅果

1引 言

堅果是一類營養價值很高的食物，其所富含的維生素、不飽和脂肪酸、抗氧化劑和微量元素等對人體生長發育、增強體質、預防疾病有極好的功效，是人們日常飲食的重要組成部分[1]。近年來，隨著人們對食品安全問題的日益關注，堅果中農藥殘留問題也逐漸引起人們的重視[2，3]。中國[4]、美國、日本以及國際食品法典委員會（CAC）等國家或組織都對堅果中的農藥殘留設定了嚴格的最大限量標準，堅果中的農藥殘留分析成為食品檢測中的一項重要內容。

液相色譜質譜聯用技術被廣泛應用于多農藥殘留檢測[5]，國標中也多采用此方法[4]。李南等[6]采用氣相色譜串聯質譜法定性和定量分析堅果中185種農藥殘留，分析時間較長。楊巍等[7]采用高效液相色譜串聯質譜法測定了堅果中62種農藥殘留，采用固相萃取法進行樣品前處理，需要使用大量的正己烷、甲苯等有機試劑。Lin等分別采用固相萃取[8]和凝膠滲透色譜（GPC）[9]凈化進行農藥的樣品前處理，但在多種類型農殘分析方面仍存在不足。QuEChERS方法使用乙腈等溶劑提取樣品，在提取液中加入合適的固體吸附劑，如PSA、C18、GCB等，達到除去基質中的干擾物和對目標組分的提取和凈化目的[10]，方法快速、可靠、經濟、簡便，被廣泛應用于水果[12，13]、蔬菜[14，15]、谷物[16]等樣品中農殘測定， 尤其適用于含水量較大的樣品中農藥的多殘留分析[11]。相比之下，堅果樣品中水分含量較低，油脂含量較高，易隨有機提取劑萃取出來，干擾測定。Zhu等[17]采用QuEChERS和高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS/MS）測定了花生中及土壤中啶氧菌酯的代謝狀況。Lopes等[18]以乙酸乙酯和乙腈混合溶劑為提取溶劑，采用改進的QuEChERS方法和超高效液相色譜串聯質譜 （UHPLCMS/MS）分析了花生中113種農殘。除此之外，QuEChERS法還可用于植物油中農殘的前處理[19，20]。以上研究結果說明，QuEChERS在富含油脂類樣品的前處理方面具有一定的應用潛力。對基于QuEChERS的樣品前處理過程改進，并采用UPLCMS/MS測定多種堅果樣品中的多種農藥殘留，仍需要進一步的研究。

花生，杏仁、腰果和核桃是我國居民經常食用的堅果。本研究選用UHPLCMS/MS法檢測堅果中的農藥殘留。樣品采用QuEChERS方法處理，用Oasis PRiME HLB小柱進一步凈化。將本方法嘗試用于這4種堅果中農藥多殘留的分析，結果令人滿意。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜Xevo TQS三重四極桿質譜儀（美國Waters公司）； CF 16RXⅡ離心機（日本HITCHI公司）； XHFD高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）； MiliQ Advangtage A10 純水儀（美國Millipore公司）； MGS2200氮吹儀（東京理化公司）。

38種農藥標準品溶液（10 μg/mL，北京振翔科技有限公司）； 甲醇、乙腈、乙酸（質譜純，Thermo Fisher公司）； 甲酸（質譜純，美國Fluka公司）； 實驗用水為超純水（符合GB/T 66822008一級水要求）； QuEChERS凈化包（含PSA、C18和MgSO4）和鹽包（MgSO4和乙酸鈉）、Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（美國Waters公司）?；ㄉ?、杏仁、腰果和核桃4種堅果樣品均購自本地超市。

2.2樣品前處理

市售堅果樣品隨機選用適量，用高速分散器磨碎后置于

Symbolm@@ 20℃保存。稱取5.0 g均質樣品于50 mL具塞離心管中，分別加入7.5 mL冰水/10 mL冰乙腈，渦旋提取1 min。再分別加入鹽包（含1.5 g乙酸鈉和6 g MgSO4），劇烈振搖1 min后， 10000 r/min離心5 min。取上層乙腈層和油脂層，加入到預先加有凈化包（500 mg PSA、500 mg C18和1500 mg無水MgSO4）的15 mL離心管中，渦旋30 s，10000 r/min離心8 min。取上清液3 mL過Oasis PRiME HLB固相萃取柱，保持每秒1滴的流速，取2 mL流出液于15 mL離心管中，在40℃水浴中氮吹近干。向其中加入1 mL流動相進行復溶，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，轉移至進樣小瓶，待測。

2.3標準溶液的配置

標準儲備溶液：購買的38種農藥標準品溶液作為儲備液，溶劑為甲醇，濃度均為10 μg/mL，4℃避光保存。

基質標準溶液的配制：樣品按照2.2節條件進行前處理后進行儀器分析，當38種農藥的定性與定量離子信噪比均小于3時，樣品確定為空白基質?？瞻谆|按照2.2節條件前處理，獲得空白基質提取液。分別平行移取8份空白基質提取液2 mL于15 mL離心管中，在40℃水浴中氮吹近干。分別加入1 mL濃度為0.5、1、2、5、10、20、50和100 μg/L的混合對照溶液（10 μg/mL混合標準儲備液用10%（V/V）甲醇水混合溶液稀釋即得），配制成相應濃度的基質匹配對照溶液（現用現配），0.22 μm微孔膜過濾，待分析。endprint

2.4液相色譜串聯質譜條件

2.4.1液相色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）； 柱溫：35℃； 進樣體積：5 μL； 進樣器溫度：4℃； 流動相A：0.1%（V/V）甲酸水溶液，流動相B：0.1%（V/V）甲酸甲醇溶液； 流速：0.3 mL/min； 梯度洗脫程序：0～0.25 min，10% B； 0.25～20 min，10%～100% B； 20～23min，100% B； 23～23.01 min，100%～10% B； 23.01～26 min，10% B。弱洗針溶液：10%甲醇90%水溶液； 強洗針溶液：80%甲醇20%水溶液，用于清洗進樣針的外壁，避免殘留。

2.4.2質譜條件離子化模式： ESI+； 毛細管電壓：3 kV； 掃描模式：多反應監測（MRM）模式； 去溶劑氣：氮氣，400℃，800 L/h； 錐孔氣：氮氣，5 L/h。38種農藥化合物的詳細質譜參數見表1。

3結果與討論

3.1液相色譜條件的優化

3.1.1流動相的選擇考察了甲醇水、甲醇（0.1%甲酸）水（0.1%甲酸）、乙腈（0.1%甲酸）水（0.1%甲酸）、甲醇（10 mmol/L乙酸銨）水（10 mmol/L乙酸銨）和乙腈（10 mmol/L乙酸銨）水（10 mmol/L乙酸銨）5種流動相在相同梯度洗脫條件下，對38種農藥化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響。結果表明，乙酸銨的引入造成抑霉唑和水胺硫磷兩種化合物不出峰。因此選用甲酸作為流動相改性劑。在甲酸濃度為0.1%時，比較了甲醇水和乙腈水兩種流動相體系。相同洗脫梯度下，甲醇水具有更好的分離效果。因此，選用甲醇水（0.1%甲酸， V/V）為流動相。

3.1.2進樣溶劑的優化乙腈是常用的稀釋溶液，然而本方法中混合標準溶液經乙腈稀釋后，大部分峰發生前延，且峰形較差。為了使樣品基質與流動相體系盡量保持一致，考慮到流動相為甲醇水（0.1%甲酸）體系，分別考察了50%（V/V）甲醇水和10%（V/V）甲醇水混合溶液的稀釋效果。采用50%甲醇水混合溶液為進樣溶劑時，前3 min內的峰均較寬。出峰時間為1.5 min處的峰為吡蚜酮的峰，發生展寬且嚴重裂分。而10%甲醇水溶液作為進樣溶劑則能獲得較好的結果。因此，實驗采用10%甲醇水作為進樣溶劑。為保持體系性質的一致性，實驗過程中，樣品經乙腈提取，提取液經凈化和氮氣吹干后，也采用10%甲醇水混合溶液復溶。

3.2質譜條件的優化

以甲醇水（0.1%甲酸， V/V）作為流動相，在正離子模式下，對38種農藥化合物的標準溶液（100 μg/L）進行全掃描，38種化合物均能獲得穩定的母離子。然后以SIM掃描模式優化Cone值； 再進行子離子掃描，每種化合物選擇2個響應值高的子離子作為定量和定性離子，進一步優化碰撞能。最后在多反應監測模式（MRM）下優化去溶劑氣溫度、流速、離子源溫度等質譜參數。在最佳條件下，38種農藥化合物均能進行定性與定量檢測，如圖1所示。

3.3前處理方法的優化

3.3.1提取溶劑的選擇在農殘分析中，常用的提取溶劑是乙腈，提取效率高，去除脂肪、蛋白質和糖分等雜質效果好，并且揮發性低。以添加水平為100 μg/kg的花生為研究對象，考察了純乙腈、含1%（V/V）乙酸的乙腈、正己烷飽和的乙腈[21] 3種提取劑對38種農藥的提取效果。結果表明，乙腈和酸化乙腈的提取回收率沒有顯著性差異。以正己烷飽和的乙腈為提取溶劑時，出峰時間較長的幾種物質回收率較低，這可能是因為正己烷飽和的乙腈能提取出更多的脂溶性物質，對弱極性農藥化合物的基質抑制效應明顯增強。乙腈雖然不能完全溶解非極性的脂肪，但仍是一種較好的提取溶劑。因此，本實驗選取乙腈作為提取溶劑。

3.3.2提取溶劑體積的確定以花生為研究對象，準確稱量5.0 g樣品，添加水平為100 μg/kg時，分別考察了乙腈體積為10、15和20 mL時對農藥殘留的提取效果。結果表明，采用10 mL乙腈能達到充分提取目標分析物的目的。

3.3.3固相萃取柱的使用與蔬菜水果等樣品相比，堅果樣品中油脂含量較高，最高達60%以上。僅采用QuEChERS凈化后，提取液中殘留的脂溶性物質及其它干擾性物質影響農藥的測定。因此，樣品提取液經QuEChERS凈化后，再經流經固相萃取柱，以達到進一步凈化的目的。以添加水平為100 μg/kg的花生為研究對象，分別檢測QuEChERS處理后的溶液及經反相固相萃取柱PRiME HLB柱進一步凈化的溶液。結果表明，經過PRiME HLB固相萃取柱進一步凈化的提取液中，38種農藥化合物的響應均有不同程度的增強。這說明固相萃取柱的使用進一步凈化了提取液，降低了基質抑制作用，因此本研究采用PRiME HLB柱進一步凈化。

3.4基質效應

基質效應為基質匹配校準曲線的斜率與溶劑標準校準曲線的斜率兩者之比，比值越接近1，則基質效應越小[22]。詳細研究了38種農藥在花生、杏仁、腰果和核桃4種堅果中的基質效應，結果列于表2。從樣品基質角度比較，核桃的基質效應最大。從38種農藥化合物角度比較，敵百蟲（Trichlorfon）和嘧霉胺（Pyrimethanil）的基質效應最為明顯。為克服基質效應，常用的方法有基質匹配標準曲線法、采用性質相近或穩定同位素內標法、減小進樣量等。其中，基質匹配標準曲線法不但效果良好，而且具有廉價、操作簡便的特點[23]。因此本研究使用配制基質匹配標準曲線的方法降低基質效應。

3.5農藥殘留在樣品提取液中的穩定性

采用空白基質提取液中加標的方法，考察了4種基質提取液中38種農藥化合物在40 h內的穩定性。核桃中嘧菌胺和花生中的甲氧蟲酰肼加標水平為25 μg/kg，其它農藥加標水平為15 μg/kg時，分別測定農藥化合物在第0、4、8、12、24和40 h的濃度，計算6個濃度數據的RSD，RSD<20%可認為沒有發生明顯降解。結果表明，在花生、杏仁、腰果的基質提取液中，38種農藥在40 h內均未發生顯著降解。核桃的基質提取液中，敵百蟲和甲氧蟲酰肼在40 h內的濃度變化明顯。在初始的8 h內兩種化合物較為穩定，8 h后發生明顯的降解，12 h后降解率達30%～40%。因此，為保證實驗數據的準確性，在實驗過程中，核桃樣品的提取液須在8 h內檢測。endprint

3.6方法學評價

3.6.1檢出限與標準曲線在優化的分析條件下，38種農藥化合物各選擇一個定量離子和一個定性離子，其在花生、杏仁、腰果和核桃4種樣品基質中檢測的線性范圍、線性相關系數、檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）列于表3。 38種農藥化合物在各自的線性范圍內，線性關系良好， 線性相關系數均大于0.991，檢出限和定量限分別為0.01～10 μg/kg和 0.05～20 μg/kg。

3.6.2精密度與加標回收率在花生、杏仁、腰果、核桃4種空白樣品中進行38種農藥化合物在3個濃度水平的加標回收率實驗?？紤]到花生、腰果和核桃中的甲氧蟲酰肼定量限分別為20、15和15 μg/kg，核桃中啶氧菌酯和嘧菌胺的定量限分別為14和20 μg/kg，3個添加水平分別為40、60和100 μg/kg。其余化合物在4種樣品基質中的定量限均不高于10 μg/kg，故其添加水平分別為20、40和60 μg/kg。每個添加水平進行6次平行實驗。采用基質匹配標準曲線進行定量分析，結果列于表4。4種堅果中38種農藥的平均回收率在51.0%～126.0%范圍內， RSD<20%。證明此樣品前處理方法及UPLCMS/MS檢測方法靈敏、準確、有效，可適用于4種堅果中38種農藥殘留的同時測定。

3.7實際樣品的分析

應用本方法測定了市售的花生、杏仁、腰果、核桃4種堅果中的農藥殘留。腰果和核桃樣品中未檢出38種農藥殘留?；ㄉ鷺悠分袡z出吡蟲啉殘留，含量為2.51 μg/kg。杏仁樣品中檢出氯蟲苯甲酰胺殘留，含量為1.39 μg/kg，兩者均未超過我國的最大殘留限量（MRLs）標準。圖2為花生和杏仁中兩種農藥殘留的提取離子色譜圖。

4結 論

本研究選擇了4種代表性的高油脂堅果（花生、杏仁、腰果和核桃），建立了QuEChERS方法凈化、PRiME HLB小柱進一步凈化、超高效液相色譜串聯質譜測定堅果中38種農藥殘留的檢測方法。本方法簡單、有效、準確，滿足痕量分析要求，適用于花生、杏仁、腰果和核桃等堅果中農藥殘留的檢測。

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Determination of 38 Kinds of Pesticide Residues in Nuts by

QuEChERSUltra Performance Liquid

ChromatographyTandem Mass Spectrometry

DONG YaLei1， LIU WenJing1，2， CAO Jin*1， WANG GangLi1

1（National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

2（China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China）

AbstractA multiresidue analysis method was developed for the determination of 38 kinds of pesticides in nuts （almonds， peanuts， cashew nuts and walnuts） by QuEChERSultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. The pesticide residues were extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up with PSA， C18 and Oasis PRiME HLB， and then analyzed by UPLCMS/MS with multiple reaction monitoring （MRM） mode. External standard method was employed to quantify. The limits of detection （LODs， S/N=3） of this method were between 0.01 and 10 μg/kg， and the limits of quantitation （LOQs， S/N=10） were between 0.05-20 μg/kg. All of the tested pesticides showed good linear relationship （r>0.991）. The practical samples were determined at three spiked levels and the average recoveries were between 51.0% and 126.0%. The RSDs were less than 20%. This method was simple， sensitive and accurate， and could be used for the routine analysis of pesticide residues in nuts.

KeywordsUltrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； QuEChERS； Multipesticide residues； Nuts

（Received 5 December 2016； accepted 23 June 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21405159）endprint