不同參數(shù)組合電針對(duì)SNL大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)觀察及對(duì)脊髓背角PGE2的影響

周杰　陳貞羽　龔杰

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)不同參數(shù)組合電針對(duì)神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制探索，篩選出電針治療神經(jīng)病理性疼痛的最佳參數(shù)組合。 方法 30只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常組（N 組）、模型組（M 組）、2 Hz電針組、100 Hz電針組和2/100 Hz電針組。采用脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）的方法建立大鼠神經(jīng)病理痛模型。用電針干預(yù)大鼠患側(cè)“足三里”和“昆侖”穴，于造模前，造模后 24 h，治療后第 1、3、5、7、9、10天檢測(cè)大鼠右后足PWTs。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)脊髓背角（SCDH）前列腺素E2（PGE2）的含量。 結(jié)果 各時(shí)間點(diǎn)，2 Hz電針組大鼠痛閾均高于M組（P<0.05）；電針治療后第3、5、7、9天，2 Hz電針組大鼠痛閾均高于100 Hz電針組（P<0.05）；電針治療后第3、5、7天，2 Hz電針組大鼠痛閾高于2/100 Hz電針組（P<0.05）；各時(shí)間點(diǎn)，2/100 Hz電針組大鼠痛閾高于M組（P<0.05）；電針治療后第3天，2/100 Hz電針組大鼠痛閾高于100 Hz電針組（P<0.05）；電針治療后第1、7、9、10天，100Hz電針組大鼠痛閾高于M組（P<0.05）。各電針組大鼠脊髓背角PGE2含量均低于M組和N組（P<0.01）。 結(jié)論 不同參數(shù)組合電針均能減輕神經(jīng)病理性疼痛，但不同參數(shù)組合電針鎮(zhèn)痛效果有所不同，以2 Hz頻率電針最佳。

[關(guān)鍵詞] 電針；頻率；神經(jīng)病理痛；鎮(zhèn)痛；參數(shù)

[中圖分類號(hào)] R454.1；R245.31+9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）24-0033-04

[Abstract] Objective To evaluate the analgesic effect of various parameter-combined electroacupuncture on neuropathic pain and its mechanism，and to select the optimal parameter combination of electroacupuncture in treatment of neuropathic pain. Methods 30 male SD rats were randomly divided into normal group（group N）， model group（group M）， 2 Hz electroacupuncture group， 100 Hz electroacupuncture group and 2/100 Hz electroacupuncture group. The neuropathic pain model was set up by spinal nerve ligation（SNL）. Electroacupuncture was used to stimulate Zusanli and Kunlun of the affected side of rats. PWTs of right rear were detected before modeling and at 24 h， 1 d， 3 d， 5 d， 7 d， 9 d， and 10 d after treatment. ELISA was used to detect the PGE2 level in spinal cord dorsal horn. Results At each time point， the pain threshold of rats was significantly higher in the 2 Hz group than in group M（P<0.05）. At 3rd， 5rd， 7rd， and 9rd after treatment， the pain threshold of rats was significantly higher in the 2 Hz group than in the 100 Hz group（P<0.05）. At day 3， 5， and 7 after treatment，the pain threshold of rats was significantly higher in the 2Hz group than in the 2/100 Hz group（P<0.05）. At each time point， the pain threshold of rats was significantly higher in the 2/100 Hz group than in group M（P<0.05）. At 3rd day after treatment， the pain threshold of rats was significantly higher in the 2/100 Hz group than in the 100 Hz group（P<0.05）. At the 1st， 7th， 9th， and 10th， the pain threshold of rats was significantly higher in the 100 Hz group than in group M（P<0.05）. The PGE2 levels in SCDH were significantly lower in each groups than in group M and group N（P<0.01）. Conclusion Various parameter-combined electroacupuncture can all reduce the neuropathic pain， but with different analgesic effects， and the frequency of 2 Hz can reach an optimal effect.endprint

[Key words] Electroacupuncture； Frequency； Neuropathic pain； Analgesia； Parameter

三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后遺痛、糖尿病周圍神經(jīng)痛等均屬于神經(jīng)病理痛（neuropathic pain），其人群患病率約0.6%～1.5%[1]，其疼痛劇烈，治療困難，患者生活質(zhì)量普遍較低[2]，臨床常用抗癲癇藥、三環(huán)類抗抑郁藥等治療，療效不確切，且副作用較大。電針（electroacupuncture，EA）是針灸臨床最常用的疼痛治療方法，廣泛應(yīng)用于各類急慢性疼痛[3，4]，且被研究證實(shí)確切有效[5，6]。電針參數(shù)是其鎮(zhèn)痛起效的關(guān)鍵，但有一份調(diào)查顯示78.4%的中醫(yī)師不清楚應(yīng)用哪種刺激參數(shù)達(dá)到最佳的鎮(zhèn)痛效果[7]。而不同研究表明，不同頻率電針對(duì)神經(jīng)病理性疼痛均有明顯的鎮(zhèn)痛作用[8-10]，這更讓臨床醫(yī)生無所適從。

課題組前期發(fā)現(xiàn)電針治療神經(jīng)病理性疼痛應(yīng)選用頻率為2 Hz、100 Hz的電針，不推薦使用15 Hz和50 Hz電針[11]，那么不同參數(shù)組合電針對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠鎮(zhèn)痛效果如何，是否疏密波電針鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于連續(xù)波？本研究經(jīng)典的脊神經(jīng)結(jié)扎[12]（spinal nerve ligation，SNL）的方法建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，應(yīng)用Master-9電刺激器，模擬電針儀輸出波形、波寬、頻率、電流等刺激參數(shù)，通過對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠行為學(xué)觀察和脊髓背角前列腺素E2（PGE2）檢測(cè)，評(píng)價(jià)不同電刺激參數(shù)組合的鎮(zhèn)痛效果，篩選出治療神經(jīng)病理痛的最佳電針參數(shù)，為臨床醫(yī)生合理使用電針參數(shù)提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)健康雄性 SD大鼠84 只，體重（180±20）g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（滬）2014-0016]。

1.2 儀器

脈沖刺激器（以色列AMPI公司，型號(hào)Master-9）、電刺激隔離器（以色列AMPI公司，型號(hào)ISO-Flex）、Digital Von Frey 測(cè)痛儀（法國 Bioseb 公司，型號(hào)BIO-EVF3）。

1.3 針灸針

華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格0.25 mm×13 mm）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為空白組（N組）、模型組（M組）、2Hz電針組、100 Hz電針組、2/100 Hz電針組，每組各6只。

1.4.2 模型制備 按照經(jīng)典Kim和Chung方法制作大鼠右側(cè)L5脊神經(jīng)結(jié)扎模型（SNL模型）建立神經(jīng)病理痛模型。

1.4.3電刺激器參數(shù)設(shè)置 Master-9電脈沖刺激器輸出參數(shù)如下：（1）波形：雙向?qū)ΨQ矩形波；（2）頻率和波寬：2 Hz電針組脈沖電刺激波寬為 50 μs；100 Hz電針組脈沖電刺激波寬為 200 μs；2/100 Hz電針組，2 Hz時(shí)，波寬為 50 μs，100 Hz時(shí)，波寬為200 μs，疏密波各持續(xù)3 s；（3）刺激強(qiáng)度和時(shí)間：各治療組均為1 mA 15 min，再2 mA 15 min，共30 min。

1.4.4 處理與治療 N組不做任何處理，自由活動(dòng)；M 組用特制的布套固定[13]，不行針灸干預(yù)；其余各電針干預(yù)組大鼠均選取右側(cè)的“足三里”穴（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處）和“昆侖”穴（后肢外踝與跟腱之間的凹陷中），穴（參照華興邦大鼠穴位圖譜），并用特制的布套固定，選用 0.25 mm×13 mm 針灸針刺激，導(dǎo)線分別連接 Master-9 針灸針和脈沖刺激器，刺激器參數(shù)如上所述。每日干預(yù) 1 次，連續(xù) 10 d。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1痛閾測(cè)試 本實(shí)驗(yàn)使用 EVF 檢測(cè)大鼠右后機(jī)械縮足閾（Paw Withdrawal Thresholds，PWTs），分別于造模前（Base），造模后 24 h（After SNL），干預(yù)后第 1、3、5、7、9、10天，共 8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，每次測(cè)量時(shí)間不少于5 s，間隔時(shí)間不少于10 s，每只大鼠共測(cè)量 3 次，取其平均值作為該只大鼠的機(jī)械縮足閾值。

1.5.2 PGE2檢測(cè) 大鼠干預(yù)第10天結(jié)束后統(tǒng)一處死，迅速分離脊髓腰段膨大部分（L4-6節(jié)段）的右側(cè)脊髓背角組織，將所取得的脊髓組織稱質(zhì)量后置于玻璃勻漿器中，按1∶10 比例冰上勻漿。勻漿液3000 r/min離心15 min，取上清液置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)大鼠脊髓背角中PGE2的水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析（ANOVA）；組間兩兩比較，方差齊性時(shí)采用 LSD（Least-Significant-Difference）檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用 Dunnetts T3 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠痛閾檢測(cè)

不同參數(shù)組合電脈沖刺激刺激對(duì)SNL大鼠 PWTs 動(dòng)態(tài)觀察（圖1）。造模后24 h，除N組外，其余各組大鼠 PWTs 均顯著下降（P<0.01），說明造模成功；電針干預(yù)后第1天，與M組相比，3個(gè)電針組大鼠PWTs 均提高（P<0.05）；電針干預(yù)后第3天，2 Hz組大鼠痛閾高于模型組、100 Hz組和2/100 Hz組（P<0.05），2/100 Hz大鼠痛閾高于模型組和100 Hz電針組（P<0.05）；電針干預(yù)后第5天，2 Hz組大鼠痛閾高于模型組、100 Hz電針組和2/100 Hz電針組（P<0.05），2/100 Hz大鼠痛閾高于模型組（P<0.01）；電針干預(yù)后第7天，2 Hz組大鼠痛閾高于模型組、100 Hz電針組和2/100 Hz電針組（P<0.05），100 Hz電針組和2/100 Hz電針大鼠痛閾高于模型組（P<0.01）；電針干預(yù)后第9天，2 Hz電針組大鼠痛閾高于模型組和100 Hz電針組（P<0.05），100 Hz電針組和2/100 Hz電針組大鼠痛閾高于模型組（P<0.05）；電針干預(yù)后第10天，三組電針組大鼠痛閾高于模型組（P<0.01）。endprint

2.2大鼠脊髓背角PGE2 含量檢測(cè)

不同參數(shù)組合電針對(duì)SNL大鼠脊髓背角PGE2含量比較（圖2），2 Hz、100 Hz和2/100 Hz電針組大鼠脊髓背角PGE2含量低于正常組和模型組（P<0.01），而三個(gè)治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)SNL大鼠患側(cè)足PWTs 來反映電針鎮(zhèn)痛效果，研究結(jié)果表明3種參數(shù)組合（2 Hz/50 μs、100 Hz/200 μs 及 2/100 Hz）電針均有明顯鎮(zhèn)痛效果，在電針干預(yù)1周之內(nèi)，2 Hz電針組不同程度優(yōu)于100 Hz電針組和2/100 Hz電針組；而電針干預(yù)1周以后，無論是低頻、高頻還是疏密波電刺激，均能提高模型大鼠的痛閾，三組之間差異不明顯。該研究結(jié)果提示在臨床治療中，我們推薦神經(jīng)病理痛的電針參數(shù)是2 Hz/50 μs。這與其他研究團(tuán)隊(duì)在電針治療糖尿病神經(jīng)痛模型上的研究結(jié)論一致，也認(rèn)為2 Hz電針治療效果更好[14]。

前列腺素E2（PGE2）是重要的致痛炎癥介質(zhì)，外周神經(jīng)損傷后，脊髓中的細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，這些炎癥因子誘發(fā)并促進(jìn)了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展[15]。本研究證實(shí)神經(jīng)病理痛模型大鼠脊髓背角PGE2表達(dá)升高，不同頻率電針均可以抑制PGE2分泌，證明電針治療神經(jīng)病理痛與抑制脊髓背角PGE2分泌有關(guān)。但是3種參數(shù)組合電針對(duì)脊髓背角PGE2表達(dá)無差異，證明三組之間的鎮(zhèn)痛效應(yīng)差別并不是源于對(duì)PGE2分泌的抑制。那么不同電針參數(shù)之間的鎮(zhèn)痛效果的差別源于何處？

本研究過程中我們觀察到在SNL后一周以內(nèi)2 Hz電針鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于其他電針參數(shù)組，而1周之后，100 Hz組和2/100 Hz組表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效應(yīng)快速顯現(xiàn)。因此本文猜測(cè)，2Hz電針有可能可以特異性地抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而100 Hz電針可以特異性地抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。這是因?yàn)榇罅垦芯孔C實(shí)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞雖均與疼痛相關(guān)，但脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活主要發(fā)生在炎癥或神經(jīng)損傷的早期階段，而星形膠質(zhì)細(xì)胞參與疼痛后期[16-21]，研究也證實(shí)電針可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化來鎮(zhèn)痛[22，23]，如果這一假說成立，那就解釋了3種參數(shù)組合電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)的差別來源，即2 Hz電針可以特異性地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而100 Hz電針可以特異性抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。當(dāng)然，這一假說需要進(jìn)一步研究來驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論是2 Hz/50 μs參數(shù)組合電針利于神經(jīng)病理痛治療，其中波寬是一個(gè)重要的電刺激參數(shù)，電針療效與電脈沖波寬有關(guān)[24]，有專家認(rèn)為，在臨床實(shí)踐中將進(jìn)一步研究不同波寬的治療效果，可以得到更精確、更合理的治療參數(shù)[25]，然而本文認(rèn)為頻率與波寬存在優(yōu)化組合，我們前期發(fā)現(xiàn)兩者均是電刺激鎮(zhèn)痛的重要參數(shù)。因此，電針儀研發(fā)人員在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮頻率與波寬的組合。除此之外，電流強(qiáng)度、刺激時(shí)間亦是影響因素，多種參數(shù)之間的最佳組合是下一步工作重點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-05-09）endprint