miR—21在心肺復蘇后大鼠血漿中的表達意義

何愛文　王東升　張倩倩

[摘要] 目的 探討微小RNA-21（miR-21）在心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后大鼠血漿中的表達差異及其意義。 方法 SD大鼠隨機分成假手術對照組（對照組）和心肺復蘇組（CPR組），每組16只。采用窒息法建立大鼠心肺復蘇模型，測定大鼠氣管切開后（對照組）或心肺復蘇后（CPR組）24 h的心率（HR）、左室收縮末壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內壓的最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等血流動力學指標。兩組于氣管切開后（對照組）或心肺復蘇后（CPR組）24 h取全血，離心取血漿，提取總miRNA，用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測血漿miR-21含量并分析血漿miR-21在兩組中表達的差異。測定CK、CK-MB和cTnI，并分析血漿miR-21與上述指標的相關性。采用計算受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）評估m(xù)iR-21、CK、CK-MB及cTnI診斷CPR后心功能障礙的效能。 結果 與對照組比較，CPR組大鼠HR、LVSEP、LVEDP、±dp/dtmax及血漿miR-21、CK、CK-MB、cTnI表達差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。相關分析表明，CPR后大鼠血漿miR-21的表達量與CK、CK-MB、cTnI和LVEDP呈正相關性，與HR、LVSEP和±dp/dtmax呈負相關（P<0.01）。血漿miR-21、CK、CK-MB和cTnI的曲線下面積分別為0.859、0.719、0.803、1.000。 結論 miR-21可能參與了CPR后心功能障礙，血漿miR-21可能是CPR后心肌損傷潛在的診斷學標志物。

[關鍵詞] 心搏驟停；心肺復蘇；心功能障礙；微小RNA-21；qRT-PCR

[中圖分類號] R459.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）24-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the difference of microRNA-21（miR-21）expression in rat plasma after cardiopulmonary resuscitation（CPR） and its significance. Methods SD rats were randomly divided into sham operation control group（control group）and cardiopulmonary resuscitation group（CPR group）， with 16 rats in each group. The model of cardiopulmonary resuscitation in rats was established by using smothering method. Hemodynamic parameters were measured after tracheotomy（control group） or after cardiopulmonary resuscitation（CPR group）， such as heart rate（HR）， left ventricular end-systolic pressure （LVESP）， left ventricular end-diastolic blood pressure（LVESP）， maximum rise and fall rate of left ventricular pressure （±dp/dtmax） and other hemodynamic parameters. Whole blood was collected 24 h after tracheotomy （control group） or cardiopulmonary resuscitation（CPR group）in both group， the plasma was collected after centrifuge， and total miRNA was extracted. The plasma miR-21 content was measured by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）and the difference of plasma miR-21 expressions between the two groups was analyzed. CK， CK-MB and cTnI were measured and the correlation between plasma miR-21 and the above indexes were analyzed. The efficacy of miR-21， CK， CK-MB and cTnI in the diagnosis of cardiac dysfunction after CPR was assessed by calculating the area under the ROC curve（AUC）. Results Compared with the control group， the differences of expressions of HR， LVSEP， LVEDP， ± dp/dtmax and plasma miR-21， CK， CK-MB and cTnI in CPR group were statistically significant（P<0.01）. Correlation analysis showed that the expression volume of miR-21 in rat plasma after CPR was positively correlated with CK， CK-MB， cTnI and LVEDP， and negatively correlated with HR， LVSEP and ± dp/dtmax（P<0.01）. The area under the curves of plasma miR-21， CK， CK-MB and cTnI were 0.859， 0.719， 0.803 and 1.000 respectively. Conclusion miR-21 may be involved in cardiac dysfunction after CPR. Plasma miR-21 may be a potential diagnostic marker for myocardial injury after CPR.endprint

[Key words] Cardiac arrest； Cardiopulmonary resuscitation； Cardiac dysfunction； MicroRNA-21； qRT-PCR

心搏驟停（cardiac arrest，CA）作為最嚴重的全身性缺血缺氧損傷，嚴重威脅人類健康。隨著“生命之門”之現(xiàn)代CPR術50余年的發(fā)展與推廣，越來越多的CA患者得到及時救治并恢復自主循環(huán)（recovery of spontaneous circulation，ROSC），但仍有約30%的患者在ROSC后24 h內死亡，CPR后心功能障礙是患者復蘇后早期死亡的主要原因之一[1]。目前尚缺乏早期、準確、敏感的預警指標評估CPR后心功能障礙，目前主要參照的是冠心病相關的生物學標志物，其存在一定的局限性，因此需要尋找新的生物標志物，為臨床上對CPR后心功能障礙的早期診斷、治療和預后判斷提供依據(jù)[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是內源性的非編碼微小RNA，通過完全或不完全性配對方式與互補mRNA結合，從而降解靶mRNA或抑制其轉錄后翻譯，可調控30%以上的人類基因表達[3]。2008年Mitchell PS等[4]在研究前列腺癌時首次報道了血漿miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血清或血漿中可以穩(wěn)定地存在，其不受內源性核糖核酸酶（RNase）活性的影響，使得miRNA有望成為疾病的生物學標志物。研究已發(fā)現(xiàn)[5]，血漿miR-21在冠心病患者中表達明顯升高，提示其可能參與了心肌梗死后心肌損傷過程，是急性心肌梗死潛在的診斷學標志物。但目前尚未見有關于CPR后血漿miR-21表達情況的文獻報道。因此，本實驗采用窒息法建立大鼠CA/CPR模型，檢測大鼠CPR后血漿miR-21的表達變化，并探討血漿miR-21在心肺復蘇后心肌損傷中的意義，為CPR后心功能障礙的診斷與預警方面提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取2015年7月～2016年1月間成年雄性SD大鼠32只，體重320～400 g，購自中國科學院上海實驗動物中心（實驗動物許可證號：SCXK（滬）2015-0007），由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心負責飼養(yǎng)。

1.2 實驗儀器與試劑

ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；梯度PCR儀、凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；UV751GD紫外/可見分光光度計（美國Beckman Coulter公司）；Univerval-32R低溫高速離心機（德國Hettich公司）；7600生化儀（上海申能生物技術有限公司）；Access免疫化學發(fā)光分析儀（美國Beckman公司）；MedLab-U/4CS生物信號采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）；HX-300動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）。miRcute miRNA Isolation Kit（天根生化科技北京有限公司），Trizol LS Reagent（美國Invitrogen公司），Bulge-Loop miRNATM qRT-PCR Prime（廣州銳博生物科技有限公司），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（東洋紡上海生物科技有限公司）。

1.3 實驗分組及心肺復蘇模型建立

根據(jù)研究目的按隨機數(shù)字表法分成假手術對照組（對照組）、心肺復蘇組（CPR組），每組16只大鼠，術前12 h禁食但不禁水。模型建立：（1）對照組：大鼠僅進行注射5%水合氯醛液腹腔注射麻醉和氣管插管、血管穿刺，不窒息不復蘇。（2）CPR組：基本操作同對照組，采用經典窒息法建立大鼠CPR模型[6]，大鼠在心臟停搏后3 min開始CPR（胸外心臟按壓+腎上腺素+呼吸機輔助通氣）。當大鼠恢復ROSC并維持24 h納入CPR組。參照Utstein標準[7]，當心電圖呈室顫、停搏或無脈性電活動，收縮壓≤25 mmHg時提示心搏驟停；當心電圖恢復自主節(jié)律，收縮壓>60 mmHg，并持續(xù)10 min以上時提示ROSC。

1.4 實驗步驟

1.4.1 大鼠心臟血流動力學監(jiān)測 兩組大鼠均常規(guī)頸動脈穿刺置管，然后接換能器及多導生理檢測儀，再連接MedLab-U/4CS生物信號采集處理系統(tǒng)，直接測定并記錄所有大鼠24 h時相的血流動力學指標，包括HR、LVESP、LVEDP、±dp/dtmax。

1.4.2 血漿總RNA的提取及質量檢測 按照miRcute miRNA Isolation Kit試劑盒的說明書提取血漿中的總RNA；采用NanoDrop ND-1000檢測RNA的濃度和純度；瓊脂糖凝膠電泳法進一步檢測總RNA的質量。實時熒光定量PCR：參照大量的文獻報道和我們前期所取得的一系列實驗研究基礎。實驗需要的逆轉錄引物由廣州銳博生物科技有限公司提供，本實驗中所采用的內參對照由廣州銳博生物科技公司提供的miRNA qRT-PCR Standard RNA作為標準品基因（cel-miR-39）外源加入血漿中作為內參。RT反應參數(shù)：42℃ 60 min，70℃ 5 min。Real-Time PCR 反應參數(shù)：95℃ 3 min，95℃ 5sec，62℃ 35sec（40個循環(huán)）。本實驗采用ABI7500熒光定量PCR儀進行檢測，每個反應做3個復孔，記錄每個孔中信號到達設定閾值時的循環(huán)數(shù)，即Ct值，計算3個孔Ct值的平均值作為最終結果。miRNA表達水平的計算方法：以cel-miR-39作為內參照，計算miR-21相對表達值RQ（RQ=2-△Ct），△Ct=Ct miR-21-Ct cel-miR-39。

1.4.3 血清CK、CK-MB和cTnI測定 采用生化儀免疫抑制法測定血清CK、CK-MB含量，Access免疫化學發(fā)光分析儀及其配套試劑測定血清cTnI含量，同時測定紅細胞壓積（HCT）值校正0.9%氯化鈉溶液稀釋的影響。endprint

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，相關性評估采用Spearman相關分析，效能評估采用ROC曲線，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠實驗基礎參數(shù)

對照組和CPR組（CA前）大鼠體質量、心率、MAP基礎值、水合氯醛使用量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組大鼠血漿miR-21表達水平變化

對照組miR-21相對表達量（2-△Ct）為（0.20575±0.06939），CPR組miR-21相對表達量（2-△Ct）為（0.57037±0.17243），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（t=7.847，P<0.01）。

2.3 兩組大鼠血流動力學變化及miR-21與HR、LVESP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的相關性

兩組大鼠于氣管切開后或心肺復蘇后24 h血流動力學指標HR、LVESP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。采用Pearson檢驗進行相關性分析，CPR后大鼠循環(huán)miR-21的表達量與HR、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax呈負相關（r= -0.563、-0.737、-0.755、-0.801，P<0.01），與LVEDP呈正相關（r=0.753，P<0.01）。見表2。

2.4 兩組血漿中CK、CK-MB和cTnI的差異及miR-21與CK、CK-MB和cTnI的相關性

CK、CK-MB和cTnI在對照組和CPR組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。采用Pearson檢驗進行相關性分析，CPR后大鼠循環(huán)miR-21的表達量與CK、CK-MB和cTnI呈正相關性（r=0.658、0.733、0.852，P<0.01）。見表3。

表3 兩組大鼠血漿中CK、CK-MB和cTnI比較（x±s）

2.5 miR-21、CK、CK-MB及cTnI在CPR大鼠的ROC曲線

CPR后大鼠miR-21表達水平的敏感性78.9%，特異性85.1%。采用ROC曲線（Receiver operating characteristic curve）評價循環(huán)miR-21相對表達量與心肺復蘇后心肌損傷的診斷是否有價值。循環(huán)miR-21表達量ROC曲線下面積AUC=0.859（95%CI 0.731～0.988），與CK、CK-MB、cTnI具有相似的敏感度（AUC分別為0.719、0.803、1.000，95% CI分別為0.519～0.919、0.622～0.984、1.000～1.000）。見封三圖3。

3 討論

CA作為全身性的缺血缺氧性損傷過程，是臨床中嚴重威脅人類健康的急危重癥，死亡率極高[8]。50余年來，隨著現(xiàn)代CPR術的建立、逐步完善與推廣普及，越來越多的CA患者得到了及時的救治，但救治成功率仍差強人意，其中心功能障礙是患者成功復蘇后早期死亡的直接原因之一[9]。本研究采用窒息法建立CA/CPR大鼠模型是經典的小動物復蘇模型，具有制作方便、所需設備簡單、重復性好的特點，能較好的模擬臨床中缺氧所導致的CA與CPR過程。同時通過檢測CK、CK-MB、cTnI能一定程度上反映病理條件下的心肌損傷，是經典的預警指標。本研究中發(fā)現(xiàn)，心肺復蘇后大鼠HR、LVESP、±dp/dtmax較對照組均明顯下降，LVEDP明顯上升，提示CA/CPR后心功能障礙明顯，尤其是左心收縮和舒張功能明顯降低。同時提示心肌損傷的指標較對照組明顯升高，提示CA/CPR后心肌細胞受損嚴重，而心肌細胞損傷則是CA/CPR后心功能障礙的根本原因。

miRNA是一類由22～23個核糖核苷酸組成的內源性非編碼微小RNA，通常來源于長鏈RNA的初始轉錄產物（Pri-miRNA），其可在RNA誘導沉默復合物引導下與互補的信使RNA（mRNA）完全或不完全性配對，從而降解或抑制mRNA轉錄后翻譯，調控著30%以上人類基因的表達[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可存在于多種體液中，如尿液、唾液、血漿、血清等，其通過與LDL、HDL、Ago等結合形成具有酶活性的蛋白質復合物，以凋亡小體、微囊泡、外來體等形式穩(wěn)定存在于體液中不被降解，即病理狀態(tài)下組織表達的miRNA通過特定途徑釋放入血并可穩(wěn)定存在[12-14]。因此，通過測定循環(huán)miRNA表達水平可一定程度上反映病理狀態(tài)下特定組織的病理變化。

miR-21定位于液泡膜蛋白基因（vacuole membrane protein-1，VMP1）非編碼區(qū)17q23.2，即VMP1的第十內含子，目前尚未發(fā)現(xiàn)特定的組織特異性。但研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下miR-21在心肌中很少表達，但在各種病理條件下心肌miR-21表達明顯升高，如急性冠脈綜合征、心力衰竭、心肌肥厚、缺血性心臟病等[15-16]。研究已發(fā)現(xiàn)，miR-21具有心血管效應的靶基因有四個，分別是磷酸酯酶-張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）和程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、Sprouty1、Sprouty2，上述基因均具有顯著的細胞和條件特異性[17-19]，因此研究認為，心血管疾病過程中miR-21可能發(fā)揮了重要作用。楊壽娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者血漿miR-21較冠狀動脈無病變者明顯升高，提示其可能參與了心肌梗死后心肌損傷過程，并預言miR-21可能是急性心肌梗死潛在的診斷學標志物。

本研究中，血漿miR-21在CPR組中表達量較對照組明顯升高，表明miR-21在CPR后心肌中表達活躍，此結果與一些學者[20-21]的研究結果一致，即心肌損傷時miR-21的表達明顯上調，其可能參與了心肌缺血相關基因的調控，調控機制復雜，多種信號轉導通路可能發(fā)揮作用，有待進一步研究。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，心肺復蘇后大鼠循環(huán)miR-21的表達量與心肌梗死診斷標志物CK、CK-MB、cTnI、LVEDP呈正相關性，與HR、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax呈負相關，即心肌損傷時miR-21表達上調，且與心功能障礙程度呈一定的相關性，提示miR-21可能參與了CPR后心功能障礙，有成為CA/CPR后心肌損傷診斷標志物的可能。ROC曲線下面積顯示miR-21與CK、CK-MB、cTnI診斷CA/CPR后心功能障礙的效能相似，高于CK和CK-MB，稍低于cTnI，敏感性78.9%，特異性85.1%，據(jù)此推斷miR-21可能是CPR后心肌損傷潛在的診斷學標志物，具有較高的敏感性和特異性，為未來的相關研究提供理論依據(jù)。endprint