阿司咪唑?qū)Π唏R魚心臟毒性的影響及其分子機制的研究

孫晨　韓利文　何秋霞

[摘要] 目的 以斑馬魚作為實驗動物，研究阿司咪唑的心臟毒性及其分子機制。 方法 選擇受精后24 h（24 hours post fertilization）的AB系斑馬魚作為實驗動物，分別暴露于不同濃度的阿司咪唑培養(yǎng)液中，處理24 h后，統(tǒng)計其死亡率并在顯微鏡下觀察心臟形態(tài)的改變，記錄心率變化，利用RT-qPCR技術(shù)檢測心臟功能相關(guān)基因表達的改變。結(jié)果 隨著阿司咪唑濃度的升高，斑馬魚胚胎逐漸出現(xiàn)死亡、心囊水腫、心臟畸形、心率下降等情況；7種心臟功能相關(guān)基因（CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4）的表達均有所下調(diào)。 結(jié)論 阿司咪唑?qū)Π唏R魚胚胎的心臟毒性具有一定的劑量依賴性，且該心臟毒性的作用機制很可能是首先干擾心臟中各離子通道相關(guān)基因的表達，進而干擾離子通道的正常功能，最終引發(fā)心臟毒性。

[關(guān)鍵詞] 阿司咪唑；斑馬魚；心臟毒性；分子機制

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）24-0041-05

[Abstract] Objective To study the cardiotoxicity of astemizole and its molecular mechanism by using zebrafish as the experimental animals. Methods Twenty-four post fertilization AB-zebrafish were selected as experimental animals and exposed to different concentrations of astemizole solution. After 24 h treatment， the mortality was calculated and the morphological changes of the heart were observed under the microscope. The heart rate changes were recorded. RT-qPCR technique was used to detect changes in cardiac function-related gene expression. Results As the concentration of astemizole was increased， zebrafish embryos gradually showed death， heart sac edema， heart deformity， heart rate decline and so on； the expression of seven cardiac function-related genes（CAV1.3a， CAV1.3b， HCN2， HCN4， KCNH2a， KCNQ1 and KCNE4） were down-regulated. Conclusion Astemizole has a dose-dependent effect on the cardiac toxicity of zebrafish embryos. The mechanism of cardiotoxicity is likely to first interfere with the expression of each ion channel-related genes in the heart， and then interfere with the normal function of the ion channel， ultimately leading to cardiotoxicity.

[Key words] Astemizole； Zebrafish； Cardiotoxicity； Molecular mechanism

近些年來，新藥研發(fā)的投入雖有大幅提高，但成功上市的新藥并沒有相應(yīng)的增多。主要原因即是在新藥研發(fā)的不同階段，特別是臨床前試驗階段，許多化合物因安全性和有效性等因素而被迫中止研發(fā)；其中心臟毒性是最為常見的因素之一[1]。建立快速測定心臟毒性的篩選模型對藥物進行早期預(yù)測評價，將有助于降低新藥研發(fā)的后期成本、提高新藥研發(fā)的成功率，因此對于降低新藥研發(fā)的風險及上市藥物的再評價等均具有非常重要的意義。

斑馬魚（zebrafish）作為一種新興的脊椎動物模式生物，其個體較小、易于飼養(yǎng)、體外受精、體外發(fā)育、胚胎及幼魚通體透明[2]，便于直接活體觀測心血管系統(tǒng)的表型改變；且在基因水平上與人類之間的同源性高達87%，約70%的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚同源基因；在蛋白水平，斑馬魚的某些關(guān)鍵部分與人類的同源性更是幾乎高達100%[3]。除此之外，斑馬魚的心臟構(gòu)成與人類非常類似，均由心房和心室構(gòu)成，房室之間存在瓣膜，且其心臟的發(fā)生和發(fā)育路線及基因調(diào)控機制等也均與人類相似[4-5]。基于上述多種特點，斑馬魚模型非常適用于心臟疾病和心臟毒理的研究。

阿司咪唑（Astemizole，AST）又稱息思敏，屬于第二代抗組胺類藥物，是一種長效的H1受體拮抗劑[6]。由于該藥在抗敏反應(yīng)的同時無明顯鎮(zhèn)靜作用，且起效快、吸收好、作用時間長，因此被廣泛應(yīng)用于過敏性疾病的治療。然而由于阿司咪唑具有心臟毒性作用，因此又限制了其在臨床上的用量。過量服用阿司咪唑可引起心臟Q-T間期延長、室性早搏、尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動過速、房室傳導阻滯、心跳驟停和心室纖顫等，嚴重者甚至引起死亡[7]。本研究選用AB系斑馬魚作為實驗對象，研究了阿司咪唑?qū)ζ湫呐K的毒性的影響及其作用機制，為斑馬魚心臟毒性模型的建立提供了可靠依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用的野生AB系斑馬魚，由山東省科學院藥物篩選技術(shù)重點實驗室提供。斑馬魚的飼養(yǎng)和繁殖參照文獻[8]。雌雄斑馬魚在28℃，14 h光照/10 h黑暗條件下分開養(yǎng)殖，每日于9：30（am）和4：30（pm）分別喂食兩次豐年蟲。交配取卵時，于前日將健康成熟斑馬魚按雌雄比1：1或1：2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置隔板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小時將成魚撈出，使排卵時間控制在半小時內(nèi)，以降低胚胎間發(fā)育時間的差異。收集受精卵，并對其進行消毒和清洗。隨后將受精卵置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)，保持14 h光照/10 h黑暗周期培養(yǎng)，并及時吸出死亡胚胎。

1.2 試劑與儀器

阿司咪唑標準品購自中國藥檢所，編號為100301。上述標準品使用二甲基亞砜（DMSO，國藥）溶解后，分別配置成4、10和20 μmol/L 的工作液。三卡因（Tricaine）貨號A5040和苯硫脲（PTU）貨號P7629均購自美國Sigma公司。RNase-free水（RNase-free water）貨號9012、RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）貨號9108、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Master Mix）貨號RR036A、 RT-qPCR試劑盒（SYBR Premix Dimer EeaserTM）貨號RR091，均購自Takara公司。

奧林巴斯公司的1X51型倒置顯微鏡、奧林巴斯公司的SZX16型熒光體視顯微鏡、北京愛生科技有限公司的斑馬魚飼養(yǎng)繁殖系統(tǒng)、Thermo Forma公司的311型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱、伯樂公司的iQ5實時熒光定量PCR儀。

1.3 加藥處理

將24 hpf（hours post fertilization）的斑馬魚胚胎置于顯微鏡下，選取發(fā)育正常的胚胎，置于6孔板中，每孔100尾，每組3個平行孔。設(shè)置1個DMSO溶劑對照組（6 mL培養(yǎng)水中加入體積濃度0.5%的二甲基亞砜）和3種不同濃度的阿司咪唑?qū)嶒灲M（6 mL培養(yǎng)水中加入終濃度為4 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的阿司咪唑溶液）。將以上各實驗組斑馬魚胚胎分別放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，14 h光照/10 h黑暗周期下，分別培養(yǎng)24 hours。

1.4 阿司咪唑?qū)Π唏R魚心臟毒性影響的檢測

各組斑馬魚加藥處理24 h后，使用三卡因?qū)⑵渎樽怼Ｔ陲@微鏡下觀察統(tǒng)計斑馬魚死亡數(shù)量、心臟形態(tài)改變；并測量其心率，測量心率時采用顯微鏡下計數(shù)斑馬魚在1 min 內(nèi)的心跳次數(shù)。

1.5 RNA提取

將各組斑馬魚置于RNAiso Plus中，使用研磨棒將其充分勻漿裂解。然后加入1000 μL氯仿，在轉(zhuǎn)速12000 rpm條件下離心15 min。收集離心后的上清層，并添加等體積的異丙醇溶液，在轉(zhuǎn)速12000 rpm條件下離心10 min。離心結(jié)束后棄去上清，添加1000 μL 75%的乙醇，在轉(zhuǎn)速12000 rpm條件下離心5 min。離心結(jié)束后棄去上清，室溫干燥沉淀，然后使用RNase-free水溶解RNA沉淀。

1.6 反轉(zhuǎn)錄

參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，設(shè)定反轉(zhuǎn)錄的總體系為20 μL，其中包括4 μL的5×PrimeScript RT Master Mix和1000 ng的RNA。上述反應(yīng)體系在37℃下放置15 min，然后置于85℃中5 s，反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA置于-20℃冰箱中備用。

1.7 RT-qPCR

熒光實時定量PCR擴增反應(yīng)的條件為95℃預(yù)變性 10 min，1個循環(huán)后，每個循環(huán)變性 95℃ 15 s，退火60℃ 1 min，共40個循環(huán)后，延伸65℃ 5 s，共61個循環(huán)，采集循環(huán)退火后的熒光信號。結(jié)果分析時以β-actin為內(nèi)參，用MXPro軟件對結(jié)果進行相對定量分析，同時對其進行統(tǒng)計學檢測。各目的基因的引物序列見表1。

1.8 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P>0.05為差異無統(tǒng)計學意義，P<0.05（或P<0.01）為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 阿司咪唑?qū)Π唏R魚的毒性影響

2.1.1 阿司咪唑?qū)Π唏R魚胚死亡活率的影響 24hpf的斑馬魚胚胎分別置于濃度0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液中，連續(xù)作用24 h后，計數(shù)其死亡率。結(jié)果顯示：當阿司咪唑濃度為0 μmol/L時，斑馬魚胚胎未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；當阿司咪唑濃度為4 μmol/L或10 μmol/L，連續(xù)作用斑馬魚胚胎24 h時，亦未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；但是當阿司咪唑濃度為20 μmol/L時，斑馬魚胚胎開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且與對照組（阿司咪唑0 μmol/L處理組）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（t=15.96，P<0.01），見表2。

2.1.2 阿司咪唑?qū)Π唏R魚心臟形態(tài)的影響 正常斑馬魚胚胎發(fā)育至24 hpf時，開始有色素生成。研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.2 mmol/L的苯硫脲（PTU）可以抑制斑馬魚胚胎色素的形成，但并不影響其心臟的發(fā)育[9]。因此在本研究中，為了便于觀察斑馬魚胚胎的心臟形態(tài)，在對照組及各實驗組培養(yǎng)液中，均加入了濃度為0.2 mmol/L的苯硫脲。不同濃度的阿司咪唑作用斑馬魚胚胎24 h后檢測發(fā)現(xiàn)：隨著藥物濃度的增加，斑馬魚胚胎均逐漸呈現(xiàn)心囊水腫、心臟畸形、血細胞堆積等現(xiàn)象，見封三圖4。

2.1.3 阿司咪唑?qū)Π唏R魚心率的影響 24hpf的斑馬魚胚胎分別在不同濃度的阿司咪唑溶液中（0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L）處理24 h后，在顯微鏡下計數(shù)斑馬魚胚胎1 min內(nèi)的心跳次數(shù)，對其心率進行統(tǒng)計。結(jié)果如表3和圖1所示：隨著阿司咪唑濃度的增加，斑馬魚胚胎的心率均有所下降，且各實驗組（阿司咪唑4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L處理組）與對照組（阿司咪唑0 μmol/L處理組）相比，差異均具有統(tǒng)計學意義。endprint

2.2 阿司咪唑?qū)Π唏R魚心臟毒性影響的分子機制

將24hpf的斑馬魚胚胎分別置于濃度0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液中，連續(xù)作用24 h后，提取斑馬魚胚胎整體組織的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述cDNA為模板，利用RT-qPCR技術(shù)，對多種與心臟功能相關(guān)的基因的表達情況進行檢測。結(jié)果如圖2所示：與對照組（阿司咪唑濃度0 μmol/L）相比，各實驗組中的CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4七種基因的表達均有所下調(diào)。進行統(tǒng)計學分析后，上述基因表達的降低趨勢均具有統(tǒng)計學意義。當不同濃度阿司咪唑處理斑馬魚胚胎24 h后，CAV1.3a和CAV1.3b兩基因的下調(diào)趨勢與阿司咪唑的作用濃度呈反比，即阿司咪唑的作用濃度越高，上述兩基因的下調(diào)程度越小；而HCN2、HCN4、KCN2a、KCNQ1和KCNE4五種基因的下調(diào)趨勢與上述兩基因不同；當阿司咪唑的作用濃度為10 μmol/L時，HCN2、HCN4、KCN2a、KCNQ1和KCNE4等五種基因的下調(diào)程度最為顯著。

3 討論

傳統(tǒng)的對藥物的心臟毒性進行研究時，常以細胞或嚙齒類動物作為研究對象，分別進行體外或體內(nèi)實驗。以細胞作為研究對象雖然具有快速高效等優(yōu)勢，但是其研究結(jié)果通常種屬差異性較大。除此之外，有些藥物的心臟毒性需要在體內(nèi)經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化后才能顯現(xiàn)，而細胞由于無法模擬上述過程，因此也就無法從機體水平對藥物的心臟毒性進行綜合全面的研究。以嚙齒類動物如小鼠或大鼠等作為實驗對象，進行體內(nèi)實驗，雖然具有綜合全面、結(jié)果可靠等優(yōu)勢，但是該研究的周期通常較長，且用藥量大。此外由于嚙齒類動物的心血管系統(tǒng)需要解剖后才能觀察其具體形態(tài)，因此無法實現(xiàn)藥物心臟毒性的高通量快速篩選評價，以及心血管系統(tǒng)的可視化分析檢測。斑馬魚由于體積較小，發(fā)育迅速，因此可在細胞培養(yǎng)板中進行大規(guī)模的同步實驗，且用藥量少，實驗周期較短，實驗過程便于操作，可實現(xiàn)藥物心臟毒性的高通量快速篩選評價。斑馬魚在發(fā)育早期由于全身透明，因此在顯微鏡下可直接觀察心血管系統(tǒng)的具體形態(tài)特征，可實現(xiàn)藥物心臟毒性的可視化分析檢測。本研究中，我們選擇斑馬魚作為實驗動物，在細胞培養(yǎng)板中對阿司咪唑的心臟毒性進行研究后發(fā)現(xiàn)：阿司咪唑?qū)Π唏R魚心臟具有一定的毒性作用，這與阿司咪唑心臟毒性的臨床報道結(jié)果相符。我們發(fā)現(xiàn)阿司咪唑連續(xù)作用24hpf的斑馬魚胚胎24 h后，會導致其心臟出現(xiàn)心囊水腫、形態(tài)畸形和血細胞堆積等異常表型，同時還會造成其心率降低。這與過去小鼠實驗的結(jié)果也相一致[10]。因此本研究進一步提示，以斑馬魚作為實驗動物，對藥物的心臟毒性進行體內(nèi)研究，其結(jié)果真實可靠；斑馬魚是研究藥物心臟毒性的新型理想動物模型。

許多研究已證實，阿司咪唑心臟毒性的作用機制與其影響心臟的起搏和阻滯心肌細胞K+通道的外向離子流密切相關(guān)[11-12]。因此在本研究中，我們對斑馬魚體內(nèi)與心臟起搏和離子通道相關(guān)的7種基因：CAV1.3a、CAV1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4等進行了研究。我們利用RT-qPCR技術(shù)首次研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚模型中，阿司咪唑可干擾上述七種基因的正常表達。所以我們認為：阿司咪唑誘導斑馬魚發(fā)生心臟毒性的作用機制很可能是首先干擾心臟中各離子通道相關(guān)基因的表達，進而干擾離子通道的正常功能，最終引發(fā)心臟毒性。

雖然在斑馬魚中，阿司咪唑可抑制CAV1.3a、CAV 1.3b、HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4等基因的表達。但是其作用濃度與各基因的下調(diào)程度之間的劑量關(guān)系卻不完全相同。CAV1.3a和CAV1.3b基因均參與編碼Ca2+通道[13]，當濃度0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液分別作用斑馬魚時，上述兩基因的下調(diào)程度與阿司咪唑作用濃度呈反比。該結(jié)果提示，阿司咪唑可通過干擾基因表達來影響Ca2+通道的功能，從而對斑馬魚心臟造成毒性。HCN2與HCN4是參與編碼環(huán)核苷酸門控陽離子通道的基因[14]；KCNH2a、KCNQ1和KCNE4是參與編碼K+離子通道的基因[15-17]。雖然HCN2、HCN4兩基因與KCNH2a、KCNQ1和KCNE4三個基因編碼的離子通道不同，但是在斑馬魚中，上述五種基因表達情況的改變與阿司咪唑作用濃度之間的劑量關(guān)系卻很相似，即當濃度為0 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的阿司咪唑溶液分別作用斑馬魚時，在10 μmol/L濃度下，上述五種基因的下調(diào)程度最大。該結(jié)果提示，阿司咪唑可通過干擾基因表達來影響環(huán)核苷酸門控陽離子通道和K+通道的功能，從而對斑馬魚心臟造成毒性。由于HCN2與HCN4兩基因參與編碼的離子通道與KCNH2a、 KCNQ1和KCNE4三種基因參與編碼的離子通道中，均具有相同的GYG標準序列[18]，因此我們推測，HCN2、HCN4、KCNH2a、KCNQ1和KCNE4五種基因之間存在一定關(guān)聯(lián)，該關(guān)聯(lián)使它們對阿司咪唑的反應(yīng)具有一定相似性。在下一步的研究中，我們將就上述五種基因之間的具體關(guān)聯(lián)做進一步研究分析。

綜上所述，本研究中我們以野生AB系斑馬魚作為實驗動物，從表型及分子機制等兩個層次分別對阿司咪唑的心臟毒性進行了體內(nèi)檢測，為斑馬魚心臟毒性模型的建立提供了可靠依據(jù)，并為今后研究藥物的心臟毒性提供了新的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2017-06-10）endprint