基于大豆粕酶解物美拉德反應制備咸味香精的研究

鄭家倫，李晨，陸利霞，熊曉輝

（南京工業大學食品與輕工學院，南京 201611）

基于大豆粕酶解物美拉德反應制備咸味香精的研究

鄭家倫，李晨，陸利霞，熊曉輝

（南京工業大學食品與輕工學院，南京 201611）

實驗以大豆粕為原料，通過酶解進而利用美拉德反應制備咸味香精。研究了堿性蛋白酶和復合植物水解酶Viscozyme L的添加順序對酶解液性質的影響。利用HPLC和GC-MS對產物的氨基酸組分及香氣成分進行分析。結果表明：先添加底物濃度10%的堿性蛋白酶，再添加底物濃度15%的復合植物水解酶Viscozyme L的酶解效果最佳，此時酶解液水解度是11.64%，還原糖含量為0.674 mg／m L，氨基氮含量為1.553 mg／m L，游離氨基酸總量達到1433.14 mg／g。從美拉德反應液中檢測出癸醛、2-癸酮、2-己基呋喃等揮發性化合物物質，它們對肉香味的生成具有重要的作用。

大豆粕；酶解液；美拉德反應

咸味香精包括豬肉香精、牛肉香精、雞肉香精、羊肉香精等具有肉制品香味的香精和各類海鮮味食用香精［1］，是20世紀70年代興起的一種新型食品香精，自20世紀80年代開始，我國開始研究咸味食品香精，而20世紀90年代則是我國咸味食品香精快速發展的10年。利用美拉德反應生產咸味香精是目前研究的熱點［2］。通過美拉德反應制得的咸味香精比起調配制得的香精，香氣更加逼真、飽滿且醇厚感更好［3］。控制美拉德反應的原料和反應條件，可以產生不同的肉香味，以美拉德反應為基料的香精質量一般較好［4］。

研究表明：水解動物蛋白、水解植物蛋白、酵母抽提物、廢骨提取物、類脂肪質等各種天然原料都可以作為氨基酸來源制取香精香料。植物蛋白有大豆粕、花生粕、小麥面筋和玉米面筋等。其氨基酸成本較低，且原料來源廣泛。大豆粕作為植物蛋白的主要來源，價格低廉且營養價值較高，符合現代人對于健康的需求。

本實驗以市售食品級大豆粕為原料，依次加入堿性蛋白酶及復合植物水解酶Viscozyme L，以此酶解得到氨基酸和還原糖。實驗無需添加任何糖類來滿足美拉德反應的條件。探究了兩種酶的最佳添加順序及添加量，利用液相色譜法對酶解液中的游離氨基酸進行分析，利用GC-MS法對美拉德反應產物進行香氣成分分析，旨在為大豆粕咸味香精的開發及制備提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆粕（食品級） 市售；Alcalase 2.4 L蛋白酶（2.4 AU-A／G），復合植物水解酶Viscozyme L（100 FEB／g）諾維信公司。

PHS-3C p H計： 上海儀電科學儀器股份有限公司；WSC-S測色差計 上海精密科學儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 南京文爾儀器設備有限公司；紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；反應釜、電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；氣質聯用儀、AG1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解液的制備

大豆粕溶液中加入復合植物水解酶Viscozyme L，簡稱V（分別為底物質量的5%，10%，15%），55℃酶解1.5 h，煮沸滅酶后冷卻到室溫，再加入堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，簡稱A（分別為底物質量的5%，10%，15%）60℃酶解2 h后。煮沸滅酶10 min，酶解液離心取上清液［5］，噴霧干燥制得酶解液干粉。調換復合植物水解酶Viscozyme L和堿性蛋白酶的加入順序，重復以上實驗。

1.2.1.1 堿性蛋白酶水解度的測定

計算方法依據p H-Stat法［6］。

1.2.1.2 酶解液還原糖濃度的測定

利用DNS法對酶解液中的還原糖進行測定［7］。

1.2.1.3 酶解液氨基氮含量的測定

利用甲醛滴定法對酶解液中的氨基氮含量進行測定［8］。

1.2.2 氨基酸組分的測定

采用高效液相色譜法［9］，OPA和FMOC柱前衍生處理。HYPERSIL ODS（C18）色譜柱：250 mm×4.6 mm×5μm；柱溫：40℃；流速：1.0 m L／min；紫外檢測器：338 nm，262 nm（Pro，Hypro）。

流動相：A相為0.6 mmol／L醋酸鈉；B相為0.15 mmol／L乙酸鈉∶乙腈∶甲醇為1∶2∶2（V／V／V）；流速為1 m L／min。

流動相：A相為稱取5.44 g結晶乙酸鈉于1000 mL燒杯中，加入1000 mL水攪拌至完全溶解，再加入200μL三乙胺，攪拌并滴加5%的醋酸，將p H調到7.20±0.05，加入5 mL四氫呋喃，混合后備用。B相為稱取5.44 g結晶乙酸鈉于800 mL燒杯中；加入200 mL水攪拌至完全溶解；滴加5%醋酸將p H調到7.20±0.05；將此溶液加入400 mL乙腈和400 mL甲醇，混合后備用。

氨基酸分析梯度洗脫表見表1。

表1 氨基酸分析梯度洗脫表

1.2.3 美拉德反應制備

咸味香精取1 g酶解液干粉，以水料比10∶1加水，將溶液置于反應釜內，將反應釜放入120℃的烘箱內加熱1.5 h。

1.2.4 褐變程度的測定

將樣品分別用去離子水稀釋至一定的倍數，在420 nm和294 nm下測定吸光值A420和A294，重復測定3次［10］，取平均值。A420nm處的吸光值代表美拉德反應后期棕褐色物質的形成程度，A294nm的吸光值代表美拉德反應中間產物的形成程度。

1.2.5 色差值的測定

采用色差計測量反應體系中色澤的變化［11］，取1.0 m L樣品注入直徑2.5 cm的樣品槽中。本體系提供3種顏色屬性，其中L*（光度，正值白，負值黑），a*（正值紅，負值綠），b*（正值黃，負值藍）。以水為參照，計算相應參數：飽和度C＝（a2＋b2）1／2；總色差ΔE＝（ΔL2＋Δa2＋Δb2）1／2。

1.2.6 頂空固相微萃取

提取揮發性成分在20 m L的頂空瓶中裝入5 m L大豆粕咸味香精，將頂空瓶放入55℃恒溫水浴中平衡30 min，再將已老化好的SPME針頭插入樣品瓶中，用手柄將石英纖維頭暴露到頂空氣體中萃取30 min后，用手柄使纖維頭推回到針頭內拔出針頭，將吸附了分析組分的萃取頭插入GC-MS進樣器中，使待測組分解吸，進入GC-MS進行分離與分析［12］。

1.2.7 氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用分析

1.2.7.1 氣相色譜條件

色譜毛細管柱為DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25μm）；載氣為He，流速1.8 m L／min；不分流；程序升溫，起始溫度40℃，保持3 min，以5℃／min的速率升溫到80℃，以10℃／min的速率升溫到160℃，保持0.5 min，以2℃／min的速率升溫到175℃，后以10℃／min的速率升溫到230℃，最后在230℃保持7 min；汽化室溫250℃［13］。

1.2.7.2 質譜條件

EI電離源，電子能量70 e V，燈絲發射電流35μA，離子源溫度200℃，接口溫度250℃，檢測器電壓350 V，掃描質量范圍35～450 m／z。

1.2.7.3 揮發性化合物的鑒定

以1.00 mg／m L 1，2-二氯苯甲醇為內標，確定揮發性化合物含量。根據GC-MS分析對大豆粕咸味香精中揮發性化合物鑒定，將分離出的化合物的質譜數據與經計算機檢索標準譜圖庫相匹配［14］。

1.2.8 感官評定

通過鮮味溶液來進行評定［15］，鮮味溶液由1.0%MSG和0.5%食鹽配制而成。各美拉德反應液按0.5%的比例加入鮮味溶液中，60℃恒溫水浴加熱10 min，進行感官評定。由經訓練過的有咸味風味劑評定經驗的6位感官評定員（3男3女）根據所提供的評價指標對樣品進行評定，打分采用7分制，將麥芽糊精的對照溶液設定為3分，分值越大表明作用效果越強。

1.2.9 數據分析

采用Microsoft Excel 2013和Matlab進行繪圖。數據分析采用SPSS 12.0進行顯著性分析（顯著性水平為p＜0.05或者p＜0.01）、本研究中所有的實驗數據都進行了平行實驗，游離氨基酸分布和GC-MS揮發性風味化合物分析平行測定2次，色差值、褐變程度、感官評定平行測定3次。

2 結果與討論

2.1 水解度測定

圖1 先加復合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶水解度

圖2 先加堿性蛋白酶后加復合植物水解酶Viscozyme L水解度

由圖1和圖2可知，隨著糖酶5%，10%，15%的不斷增大，酶解液的水解度并無顯著性增加，因此糖酶加入的多少并不影響水解度的大小。而堿性蛋白酶從5%增加到10%時，水解度有明顯的增加，而從10%增加到15%時并無顯著增加，可能是因為加入10%底物濃度的堿性蛋白酶時已將酶解液中的蛋白質基本水解成氨基酸，從而再加入更多的堿性蛋白酶效果并不顯著。由圖1和圖2還可知，先加入堿性蛋白酶后加入糖酶的樣品比先加入糖酶后加入堿性蛋白酶的樣品有更好的水解度。

2.2 還原糖的測定

圖3 先加復合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶還原糖含量

圖4 先加堿性蛋白酶后加復合植物水解酶Viscozyme L還原糖含量

由圖3和圖4可知，堿性蛋白酶的加入對大豆粕酶解液還原糖含量并無顯著性差異影響。而隨著復合植物水解酶Viscozyme L 5%，10%，15%的不斷增加，還原糖含量不斷增加，復合植物水解酶Viscozyme L從5%到10%還原糖含量增加迅速，從10%增加到15%時的幅度不大，可見還原糖含量隨糖酶增加的速率變緩。同時，由圖3和圖4還可知，先加入堿性蛋白酶后加入復合植物水解酶Viscozyme L的樣品的還原糖含量要高于同樣條件下先加入復合植物水解酶Viscozyme L后加入堿性蛋白酶的樣品。

2.3 氨基氮含量測定

圖5 先加復合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶氨基氮含量

圖6 先加堿性蛋白酶后加復合植物水解酶Viscozyme L氨基氮含量

由圖5和圖6可知，增加復合植物水解酶Viscozyme L的加入量對氨基氮含量并無顯著差異影響。而堿性蛋白酶對大豆粕酶解液氨基氮含量存在顯著性差異。堿性蛋白酶從5%增加到10%時，氨基氮含量有明顯的增加，而從10%增加到15%時增加不明顯，和水解度基本保持一致。由圖5和圖6可知，先加入堿性蛋白酶后加入復合植物水解酶Viscozyme L的樣品比先加入復合植物水解酶Viscozyme L后加入堿性蛋白酶的樣品氨基氮含量更高。

2.4 游離氨基酸的測定

從檢測出的17種氨基酸中挑選出相對含量較高的4種氨基酸，見表2。

表2 游離氨基酸含量測定表 mg／100 g

由表2可知，樣品中的氨基酸含量隨著堿性蛋白酶的增加而增多，且10%較5%增加明顯，15%較10%氨基酸含量增加不明顯。進一步驗證了加入底物濃度10%的堿性蛋白酶時酶解液中的蛋白質可能已經被完全分解成氨基酸。因此，繼續加入堿性蛋白酶氨基酸含量并沒有顯著的增加。其中先加入底物濃度10%的堿性蛋白酶后加入底物濃度15%的復合植物水解酶Viscozyme L的樣品中游離氨基酸總量達到了最大值1433.14 mg／g，精氨酸382.93 mg／g，丙氨酸149.34 mg／g，谷氨酸160.13 mg／g，天冬氨酸97.91 mg／g均達到了最大值。

2.5 褐變程度測定

表3 褐變程度測定表

420 nm和294 nm處的吸光值越高，顏色越深。由表3可知，隨著堿性蛋白酶和復合植物水解酶Viscozyme L的增加，吸光值隨之增大。通過對數據分析發現，酶解液的水解度和還原糖濃度對其美拉德反應液褐變程度的影響都具有顯著性。且相比較而言還原糖濃度對美拉德反應液褐變程度的影響更顯著。同時，先加入堿性蛋白酶后加入復合植物水解酶Viscozyme L的樣品比先加入復合植物水解酶Viscozyme L后加入堿性蛋白酶樣品的褐變程度更深。先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復合植物水解酶Viscozyme L的樣品，420 nm處吸光值達到0.175，294 nm處吸光值達到0.246。

2.6 色差值測定

表4 樣品色差值測定表

由表4可知，隨著堿性蛋白酶和復合植物水解酶Viscozyme L的增多，美拉德反應液的總色差越大，樣品顏色越暗，飽和度越大。通過對數據分析發現，酶解液中的還原糖濃度和水解度都對美拉德反應液的顏色具有顯著性影響。且還原糖濃度對反應液顏色的顯著性略微比水解度的顯著性高。先加堿性蛋白酶后加復合植物水解酶Viscozyme L的樣品略微比先加復合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶的樣品的顏色深。先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度糖酶樣品的總色差值達到68.03836，飽和度達到56.255。反應液顏色相對不是很深，且比較飽和，同褐變程度測定的結果基本一致。

2.7 揮發性成分分析

表5 美拉德反應液揮發性化合物成分（mg／m L）

續 表

對美拉德反應液的香氣成分進行分析，發現先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度復合植物水解酶Viscozyme L的樣品檢測出來的香氣成分最多且含量相對較高。共檢測出37種香氣成分，其中4種烴類化合物（2.3%）、7種醇類化合物（20.63%）、6種酯類化合物（15.66%）、3種醛類化合物（8.61%）、5種酮類化合物（7.25%）、5種芳香族類化合物（6.03%）、1種吡嗪類化合物（1.42%）、2種呋喃類化合物（1.1%）、2種吡啶類化合物（1.15%）和2種腈類化合物（1.16%）。酯類物質對酶解液整體的風味具有重要的協調作用，賦予酶解液更有層次的香氣。醛類化合物是氨基酸和糖類物質strecker降解后產生的斯特雷克爾醛，經由轉胺、脫羧基反應產生的。另外，呋喃、吡嗪類化合物通常具有強烈的肉香風味和燒烤風味。

2.8 感官評定

感官評定是在各感官評定員無顯著性差異的基礎上進行的，將18個樣品進行了感官評定，然后選取了其中7種感官評定較好的樣品，具體結果見圖7。

圖7 7種樣品的感官評定結果

由圖7感官評定結果可知，隨著復合植物水解酶Viscozyme L的不斷增加，酶解液中的還原糖含量不斷增加，導致美拉德反應液的焦甜味也隨之提升。同時，酶解液中的游離氨基酸越多，美拉德反應液的醇厚感和持續性也更好。綜合各因素，感官評定員對先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復合植物水解酶Viscozyme L的樣品有最高的評價。其表現出了更強的鮮味、肉香味，雖然其持續性和醇厚感并不突出，但它的苦味明顯弱于其他樣品，擁有較好的呈味效果。因此綜合考慮，先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復合植物水解酶Viscozyme L樣品的感官評價要優于其他樣品。

3 結論

實驗通過對大豆粕酶解液的水解度、還原糖含量、氨基氮含量、游離氨基酸含量等指標的測定，確定了大豆粕的最佳酶解順序，即先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復合植物水解酶Viscozyme L，此時酶解效果最佳，水解度為11.64%，還原糖含量為0.674 mg／mL，氨基氮含量為1.553 mg／mL，游離氨基酸總量達到1433.14 mg／g，其中精氨酸382.93 mg／g，丙氨酸149.34 mg／g，谷氨酸160.13 mg／g，天冬氨酸97.91 mg／g，均達到了最高值。

通過GC-MS法對美拉德反應產物進行香氣成分分析，其中先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復合植物水解酶Viscozyme L樣品的香氣成分更為豐富，共檢測出37種香氣成分，其中醛類、醇類、酮類、呋喃類、吡啶類等對產物的肉香味生成具有重要的作用。同時樣品的總色差值達到68.03836，飽和度達到56.255，其在420 nm處吸光值達到0.175，在294 nm處吸光值達到0.246。通過對各樣品進行感官評定分析，同樣先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復合植物水解酶Viscozyme L的樣品得到了最好的感官評價，其肉香味和鮮味更為突出。

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Research on Savory Flavoring Prepared by Maillard Reaction Based on Soybean Meal Hydrolysate

ZHENG Jia-lun，LI Chen，LU Li-xia，XIONG Xiao-hui
（College of Food Science and Light Industry，Nanjing Tech University，Nanjing 201611，China）

The soybean meal is used as raw material to prepare savory flavoring by enzymolysis and Maillard reaction.The effects of alkaline protease and complex photolytic enzyme Viscozyme L on the property of enzymatic hydrolysate are investigated.The amino acid composition and aroma components of the product are analyzed by HPLC and GC-MS.The results show that the enzymolysis efficiency of Viscozyme L is the best when the concentration of alkaline protease is 10%and the concentration of substrate is 15%.The hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate is 11.64%，the content of reducing sugar is 0.674 mg／m L，the content of amino nitrogen is 1.553 mg／m L，and the total amount of free amino acid is 1433.14 mg／g.Volatile compounds such as decanal，2-decanone and 2-hexylfuran are detected from Maillard reaction liquid，and they have an important effect on meat flavor formation.

soybean meal；enzymatic hydrolysate；Maillard reaction

TS264.3

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.002

1000-9973（2017）10-0004-07

2017－04－15

江蘇省自然科學基金青年基金項目（BK20150950）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31501529）

鄭家倫（1992－），男，碩士，研究方向：咸味香精。