發酵兔肉醬制品工藝條件的研究

王東

（常州旅游商貿高等職業技術學校，江蘇常州 213032）

發酵兔肉醬制品工藝條件的研究

王東

（常州旅游商貿高等職業技術學校，江蘇常州 213032）

文章以野兔肉為原料，將發酵劑的接種量、發酵溫度、發酵時間和食鹽添加量4個工藝參數作為試驗因素，在單因素試驗的基礎上，設計合理的因素和水平，利用響應面優化設計法（RSM）［1］，以p H和氨基酸態氮為評價產品質量的指標，確定最佳的發酵工藝組合。

兔肉醬；發酵劑接種量；發酵溫度；發酵時間；食鹽添加量；影響

單一發酵劑發酵肉制品難以得到理想的產品，而混合發酵劑可以彌補單菌種發酵的缺陷，乳酸菌和葡萄球菌發揮各自的優勢，有效提升制品的感官品質及風味［2］。人工控制的發酵工藝條件對發酵劑發揮其優良性能具有十分重要的意義，進而直接決定發酵的成功與否以及產品的質量。因此有必要探索最適宜的發酵工藝參數以達到最理想的效果。發酵過程中影響產品質量的工藝參數主要包括：發酵劑的接種量、發酵溫度、發酵時間和食鹽添加量等。

1 材料與方法

1.1 原材料及菌種

菌種：植物乳桿菌L21、葡萄球菌C5。

原料：無土腥味的野兔肉，由鹽城市食為天野兔專業合作社提供。

輔料：葡萄糖、蔗糖，A.R.級；食鹽、脫皮芝麻、香辣醬、豆豉，均為市售食品級。

1.2 主要試劑

NaOH、甲醛等，均為A.R.級。

1.3 主要儀器與設備

HSX-250型恒溫恒濕培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；p HS-3C型精度p H計 上海精密科學儀器有限公司；QYC-200型全溫培養搖床 上海新苗醫療器械制造有限公司；YX280B 型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；79-1型磁力加熱攪拌器 常州國華電器有限公司；JA2003型電子分析天平 上海天平儀器廠；DT-200型電子天平常熟雙杰測試儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 制作方法及操作要點

1.4.1.1 基本配方

兔肉、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、水12%、豆豉4%、脫皮芝麻2%、四川香辣醬4%。

1.4.1.2 制作方法

兔肉解凍→預處理→絞碎→拌料（加蔗糖、葡萄糖、食鹽和水）→接種→發酵→拌料（加豆豉、芝麻和香辣醬）→真空包裝（高溫蒸煮袋）→滅菌→成品。

1.4.1.3 發酵劑菌液制備

對篩選菌株進行糖類發酵試驗，采用生化反應管檢驗，通過觀察菌株對各種糖的利用情況確定其屬種。將待鑒定菌株接種于生物反應管后于30℃培養24 h，觀察培養基的顏色是否變化，若變為黃色，則為陽性，表明可發酵該糖并產酸。

1.4.1.4 操作要點

兔肉預處理：將冷凍兔肉置于室溫下解凍約4 h，清洗，去筋膜，絞碎。

接種發酵：肉糜中加入蔗糖、葡萄糖、食鹽和水，混勻，添加發酵劑，再混勻攪拌。

發酵：密封，避光，于適宜條件下發酵。

拌料：發酵完成后，添加豆豉、芝麻和香辣醬等調味料制醬。

包裝滅菌：將發酵成熟的兔肉放入耐高溫的包裝袋中，真空包裝，封口，高壓鍋121℃滅菌20 min，同時起到熟化肉醬的作用。

1.4.2 菌種配比對兔肉醬發酵的影響

以2%的接種量接種，設定L21與C5菌種配比分別為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，25℃條件下發酵兔肉醬48 h。測定指標，研究菌種配比對兔肉醬發酵的影響。

1.4.3 單因素試驗設計

在確定發酵劑菌種最佳配比的基礎上，進行以下單因素試驗。

1.4.3.1 接種量對兔肉醬發酵的影響

采用最佳菌種配比，添加食鹽2.5%，在25℃條件下分別接種0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%發酵劑發酵兔肉醬48 h，測定指標，研究接種量對兔肉醬發酵的影響。

1.4.3.2 發酵溫度對兔肉醬發酵的影響

采用最佳菌種配比，以2.0%的接種量接種，添加食鹽2.5%，分別在17，21，25，29，33，37℃條件下發酵兔肉醬48 h，測定指標，研究發酵溫度對兔肉醬發酵的影響。

1.4.3.3 發酵時間對兔肉醬發酵的影響

采用最佳菌種配比，以2.0%的接種量接種，添加食鹽2.5%，在適宜溫度條件下，分別進行16，24，32，40，48，56 h兔肉醬發酵，測定指標，研究發酵時間對兔肉醬發酵的影響。

1.4.3.4 食鹽添加量對兔肉醬發酵的影響

采用最佳菌種配比，以2.0%的接種量接種，分別添加1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%的食鹽，在適宜的溫度條件下發酵適宜的時間，測定指標，研究食鹽添加量對兔肉醬發酵的影響。

1.4.4 響應面試驗設計優化發酵工藝

根據單因素試驗結果，運用軟件Design Expert 8.0.6進行試驗設計，通過回歸方程的構建擬合因素與響應值之間的函數關系，尋求最優的變量組合。本試驗使用Box-Behnken設計，對影響發酵的3個因素發酵溫度（A）、發酵時間（B）和食鹽添加量（C）進行優化組合，響應值為發酵產品p H值和氨基酸態氮含量［3］。

Box-Behnken設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因素與水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.4.5 指標測定

1.4.5.1 p H值測定

將適量樣品用組織搗碎機絞碎后，準確稱取10.00 g于燒杯中，加入90 m L煮沸后冷卻（除去CO2）的蒸餾水，攪拌混勻并浸泡30 min，取上清液，用p H計測定。

1.4.5.2 氨基酸態氮含量測定

采用甲醛滴定法測定［4］。首先加入甲醛固定氨基酸氨基的堿性，顯示出羧基的酸性，用NaOH標準溶液滴定，以酸度計判斷滴定終點，用消耗的NaOH溶液體積計算氨基酸態氮含量。

1.4.6 數據處理

每個試驗重復3次，取平均值。用SPSS 17.0和Excel 2007對試驗數據進行分析，數據采用方差分析，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 菌種配比對發酵兔肉醬的影響

圖1 菌種配比對發酵兔肉醬p H和氨基酸態氮含量的影響Fig.1 Influence of culture proportion on p H and amino acid nitrogen of rabbit meat

由圖1可知，菌種配比對發酵兔肉醬p H和氨基酸態氮含量有顯著影響。由于乳酸菌的作用，添加不同配比的發酵劑發酵后的兔肉醬p H均比原料肉的p H（經測定為5.93）小。L21與C5的菌種配比為4∶1時，p H為最低值4.70，與原料肉相比變化最大，隨著葡萄球菌C5比例的增大，p H呈上升趨勢，菌種配比1∶4時達到5.62，與原料肉相比變化不大。但p H＜5.0時，酸度太大，不符合中國人的口味；若p H＞5.5，則不能有效抑制雜菌的生長，無法保證產品安全性；p H值在5.0～5.3，不但能基本抑制雜菌生長，保證產品安全性，且酸度適中，口感良好。菌種配比1∶3和1∶2的p H在此范圍內。而氨基酸態氮含量隨著C5比例的增大而呈逐漸增加的趨勢。綜合這2個指標，相對其他配比，菌種配比1∶3的氨基酸態氮含量較高，而p H較適宜。因此，選擇L21與C5的菌種配比為1∶3。

2.2 單因素發酵條件的研究

不同接種量、發酵溫度、發酵時間和食鹽添加量都是影響發酵產品p H和品質的因素。因此，首先對這些影響因素進行單因素試驗，在此基礎上進行優化試驗和響應面分析，以確定最佳發酵工藝參數。

2.2.1 接種量對發酵兔肉醬的影響

圖2 接種量對發酵兔肉醬p H和氨基酸態氮含量的影響Fig.2 Influence of inoculum size on p H and amino acid nitrogen of rabbit meat

由圖2可知，不同的接種量對p H和氨基酸態氮含量的影響都不是很大，p H值基本在5.2～5.4。隨著接種量的增加，p H值呈現不明顯的下降趨勢，氨基酸態氮含量雖有所增加，但幅度較小。

接種量必須保證乳酸菌和葡萄球菌能夠迅速成長，成為兔肉中的優勢菌，以抑制雜菌生長。而試驗中所用的菌種原液為108cfu／m L，此數量級對于兔肉發酵來說已足夠滿足需求。因此，在這一數量級上的接種量變化對發酵影響很小。

2.2.2 發酵溫度對發酵兔肉醬的影響

圖3 發酵溫度對兔肉醬p H和氨基酸態氮含量的影響Fig.3 Influence of fermentation temperature on p H and amino acid nitrogen of rabbit meat

由圖3可知，不同發酵溫度對p H和氨基酸態氮含量的影響較大。發酵溫度為17℃時，p H值為5.56，與原料肉的p H 5.93相比下降程度較小，表明在這一溫度下發酵劑的作用效果不明顯。隨著溫度的上升，p H值呈下降趨勢，當溫度超過29℃時，p H值降至5以下，酸度過大。而當發酵溫度在21～25℃時，p H值在5.0～5.3之間，酸度適宜。氨基酸態氮含量隨著發酵溫度的升高，呈逐漸增加的趨勢，表明溫度的升高有助于發酵劑的生長以及酶活力的增強，對蛋白質的分解加快。

發酵溫度過高，使發酵速度過快，導致最終p H難以控制和原料的過度分解，影響產品品質。同時，過高的溫度也會導致原料肉的雜菌和病原微生物生長繁殖，不利于保證產品的安全性。適宜的低溫，有助于保證發酵產品的柔和口感以及良好的組織狀態，從而兼顧了品質和安全性。因此，選擇發酵效果較良好的21～25℃作為發酵溫度的響應面優化范圍。

2.2.3 發酵時間對發酵兔肉醬的影響

圖4 發酵時間對發酵兔肉醬p H和氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Influence of fermentation time on p H and amino acid nitrogen of rabbit meat

由圖4可知，不同發酵時間對p H值和氨基酸態氮的影響較大。p H值隨著發酵時間的增加呈下降趨勢。發酵的前24 h p H下降比較緩慢，降低程度不明顯，這一時期發酵劑菌體處于生長繁殖期。在發酵32 h后，p H下降速度加快，開始低于5.4，能有效抑制病原微生物等雜菌的生長。而隨著發酵時間延長，氨基酸態氮含量逐步增加，且24 h后增加較快。綜合兩者，選擇40～56 h作為發酵時間的響應面優化范圍。

2.2.4 食鹽添加量對發酵兔肉醬的影響

圖5 食鹽添加量對發酵兔肉醬p H和氨基酸態氮含量的影響Fig.5 Influence of additive amount of salt on p H and amino acid nitrogen of rabbit meat

在肉品中添加一定量的食鹽，不但可以調味和促進良好風味的形成，而且通過影響滲透壓，能抑制某些不良微生物的生長，但對發酵劑也可能會有抑制作用。由圖5可知，不同的食鹽添加量對p H值影響較大，隨著鹽濃度的增加p H呈上升趨勢，表明食鹽在一定程度上抑制了乳酸菌的生長，其產酸能力受到鹽濃度的影響，鹽濃度越高，抑制越強。而氨基酸態氮的含量在1.0%～2.5%鹽濃度范圍內保持高水平，當鹽濃度超過2.5%開始下降，表明發酵劑生長及其蛋白酶活力受到影響。

食鹽濃度過低，不能抑制有害微生物的生長，不利于保證制品的安全性和優良食用品質；大于3%的食鹽濃度雖可抑制許多微生物的生長，但也包括發酵劑，從而影響肉的發酵，同時過高的食鹽濃度也影響肉制品的感官品質。綜合考慮，選擇1.5%～2.5%作為食鹽添加量的響應面優化范圍。

2.3 響應面優化發酵條件結果分析

以食鹽添加量、發酵溫度、發酵時間為因素，通過試驗優化兔肉醬發酵條件，試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案與試驗結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

使用軟件Design Expert 8.0.6對試驗數據進行二次回歸擬合，得到以響應值p H對自變量食鹽添加量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）為模型的二次多項回歸方程：

通過方差分析進一步驗證回歸模型及各參數的顯著性，結果見表3。

表3 發酵兔肉醬p H值回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of p H value

由表3可知，p H值的回歸模型極顯著（P＜0.0001），表明模型的擬合度較好。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率［5］，失擬項P＝0.1846＞0.05，差異不顯著，表明回歸模型在被研究的整個回歸區域不失擬，殘差是由隨機誤差產生的。軟件分析得到模型決定系數R2＝0.9885，表明模型相關性（擬合度）較好。校正決定系數為0.9737，表明97.37%的試驗數據的變異性（響應值變化）可用此回歸模型來解釋，僅有2.63%的變異不能用該模型解釋。變異系數反映模型的置信度，CV＝0.49%，信噪比（Adeq Precision）＝20.992＞4，表明試驗誤差小，試驗數據可靠性和精確度較高。該回歸模型可用于對食鹽添加量、發酵溫度、發酵時間3個參數進行優化并分析它們對兔肉醬p H值的影響。也證明p H值與試驗選擇的因素之間存在顯著的回歸關系，試驗設計是恰當的。

方差分析結果中，一次項B，C，二次項A2，B2，C2，交互項BC對響應值p H的影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對p H的影響顯著（P＜0.05），其余不顯著。表明兔肉醬的p H值與食鹽添加量、發酵溫度和發酵時間有著顯著或者極顯著的關系，試驗設計的因素和水平選擇是正確的。

為研究因素之間的交互作用，利用軟件繪制響應面曲線圖和等高線圖進行分析。

圖6 食鹽添加量和發酵溫度對發酵兔肉醬p H值影響的響應面和等高線圖Fig.6 Reponse surface and contours of mutual-influence of salt additive amount and fermentation temperature on p H value

由等高線圖可直觀地看出兩因素交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反［6］。由圖6可知，發酵時間為48 h時，食鹽添加量和發酵溫度對發酵兔肉醬p H值的交互影響。等高線均呈橢圓形，表明圖中兩因素交互作用顯著。隨著食鹽添加量的增加，p H先下降然后緩慢上升；隨發酵溫度的上升，p H先下降然后上升，二者交互作用顯著。

圖7 食鹽添加量和發酵時間對兔肉醬p H值影響的響應面和等高線圖Fig.7 Reponse surface and contours of mutual-influence of salt additive amount and fermentation time on p H value

由圖7可知，發酵溫度為23℃時，食鹽添加量和發酵時間對p H的交互影響效應。從其等高線圖可以直觀的看出兩因素的交互作用顯著，在試驗水平范圍內，p H值隨食鹽添加量的增加和發酵時間的延長都呈現先減小后增加的趨勢。

圖8 發酵溫度和時間對兔肉醬p H值影響的響應面和等高線圖Fig.8 Reponse surface and contours of mutual-influence of fermentation temperature and time on p H value

由圖8可知，在食鹽添加量為2%時，發酵時間和發酵溫度的交互影響效應。可以看出兩因素的交互作用顯著，在試驗范圍內，p H值隨發酵時間的延長和發酵溫度的增加都呈現先減小后增加的趨勢。

使用軟件Design Expert 8.0.6對試驗數據進行二次回歸擬合，得到以響應值氨基酸態氮對自變量食鹽添加量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）為模型的二次多項回歸方程：

氨基酸態氮含量＝0.11－1.700E-003A－6.750E-004B－1.125E-003C＋1.875E-003AB－1.025E-003AC＋5.250E-004BC－4.163E-003A2－3.913E-003B2－3.962E-003C2。

通過方差分析進一步驗證回歸模型及各參數的顯著性。

表4 發酵兔肉醬氨基酸態氮含量回歸模型方差分析結果Table 4 ANOVA for response surface quadratic model of amino acid nitrogen

由表4可知，氨基酸態氮含量的回歸模型極顯著（P＜0.01），模型的擬合度較好。失擬項P值＝0.1172＞0.05，表明回歸模型在被研究的回歸區域不失擬，殘差是由隨機誤差產生的。軟件分析得到模型決定系數R2＝0.9340，表明模型相關性良好，試驗誤差小。校正決定系數為0.8492，表明84.92%的試驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋。變異系數CV＝1.64%，信噪比（Adeq Precision）＝9.227＞4，表明試驗可靠性和精確度較高。該回歸模型可用于分析響應值氨基酸態氮含量的變化。方差分析結果中，一次項A，二次項A2，B2，C2都是顯著影響因子（P＜0.05）。

通過軟件繪制響應面曲線圖和等高線圖來分析各因素之間的交互作用。

圖9 食鹽添加量和發酵溫度對兔肉醬氨基酸態氮影響的響應面和等高線圖Fig.9 Reponse surface and contours of mutual-influence of salt additive amount and fermentation temperature on AN content

由圖9可知，發酵時間為48 h時，食鹽添加量和發酵溫度對氨基酸態氮含量的交互影響效應。觀察其等高線可知食鹽添加量和發酵溫度的交互作用顯著，氨基酸態氮含量隨著食鹽添加量和發酵溫度的增加都是先升后降，中間水平存在一個最高點。

圖10 食鹽添加量和發酵時間對兔肉醬氨基酸態氮影響的響應面和等高線圖Fig.10 Reponse surface and contours of mutual-influence of salt additive amount and fermentation time on AN content

由圖10可知，發酵溫度為23℃時，食鹽添加量和發酵時間對氨基酸態氮含量的影響。可以看出，食鹽添加量和發酵時間交互作用顯著，在試驗范圍內，氨基酸態氮含量隨著發酵時間的延長和食鹽添加量的增加呈現先升后降的趨勢。

圖11 發酵溫度和時間對兔肉醬氨基酸態氮影響的響應面和等高線圖Fig.11 Reponse surface and contours of mutual-influence of fermentation temperature and time on AN content

由圖11可知，在食鹽添加量為2%時，發酵溫度和發酵時間對氨基酸態氮含量的交互作用。可以看出，兩者交互效應顯著，隨著發酵時間的延長和發酵溫度的增加，氨基酸態氮含量呈現先升后降的趨勢。

由回歸方程的三維響應面圖和等高線圖可以看出，響應值p H存在最小值，氨基酸態氮含量存在最大值，發酵兔肉醬優化工藝條件存在穩定點。經軟件分析計算，得到p H預測值最小，氨基酸態氮預測值最大時的發酵條件：食鹽添加量為1.96%，發酵溫度為23.07℃，發酵時間為46.43 h。此時軟件預測的p H理論值為4.96799，氨基酸態氮含量為0.109216 g／100 g。考慮到實際操作的方便，將條件調整為：食鹽添加量2.0%，發酵溫度23.1℃，發酵時間46.5 h［7］。

采用調整后的優化工藝條件進行兔肉醬發酵，得到的發酵產品的p H為4.97，氨基酸態氮含量為0.1102 g／100 g，兔肉醬的品質最佳。這表明模型是合理有效的，理論值和實際值之間擬合性良好。

3 結論

L21與C5的菌種配比為1∶3時，氨基酸態氮含量達到較高，而p H值較適宜，可作為混合發酵劑的最佳比例。

單因素試驗結果表明：接種量對氨基酸態氮和p H的影響不顯著，不作為優化因素；食鹽添加量的最佳范圍是1.5%～2.5%，發酵溫度的最佳范圍是21～25℃，發酵時間的最佳范圍是48～56 h。確定食鹽添加量、發酵溫度和發酵時間3個因素的優化范圍后，采用Box-Behnken試驗設計，以發酵兔肉醬的p H值和氨基酸態氮含量為指標，利用響應面分析進行發酵條件的優化。

通過響應面分析得到最佳的工藝參數：食鹽添加量2.0%，發酵溫度23.1℃，發酵時間46.5 h。在此條件下發酵產品的p H為4.97，氨基酸態氮含量為0.1102 g／100 g，發酵的兔肉醬綜合品質最佳。

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Research on Process Conditions of Fermented Rabbit Meat Sauce

WANG Dong
（Changzhou Technical Institute of Tourism＆Commerce，Changzhou 213032，China）

Use four technological parameters such as inoculum size of starter，fermentation temperature，fermentation time and salt additive amount as experimental factors based on the raw material rabbit meat.On the basis of single factor test，the reasonable factors and levels are designed，RSM is used，the product quality is evaluated according to p H and amino nitrogen，so the best fermentation process combination can be determined.

rabbit meat sauce；inoculum size of starter；fermentation temperature；fermentation time；salt additive amount；effect

TS251.61

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.023

1000-9973（2017）10-0103-08

2017－04－17

王東（1983－），男，講師，碩士，研究方向：旅游管理、烹飪教育教學管理、食品科學（烹飪方向）。