高效液相色譜法測定白靈菇中熒光增白劑含量

張春芳 曹秀梅 佟 琦* 楊衛軍 張嘉楠 楊趙偉

(1 河北省應用化學重點實驗室 燕山大學環境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004；2 秦皇島市農產品質量安全監督檢驗中心，河北 秦皇島 066004)

高效液相色譜法測定白靈菇中熒光增白劑含量

張春芳1曹秀梅2佟 琦1*楊衛軍2張嘉楠2楊趙偉2

(1 河北省應用化學重點實驗室 燕山大學環境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004；2 秦皇島市農產品質量安全監督檢驗中心，河北 秦皇島 066004)

建立了用高效液相色譜法同時測定白靈菇中3種熒光增白劑(VBL、CBS、CXT)的方法。試樣用乙醇-水(V/V=1/2)溶液作提取劑，50 ℃條件下水浴靜置提取15 min。采用C18(250 mm×4.6 mm，2.6 μm)為分析柱，以乙酸銨(20 mmol/L)+乙腈[65+35]為流動相洗脫，流速為0.8 mL/min。3種熒光增白劑在0.01～10 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.997；加標回收率為79%～90%。方法簡單準確，線性關系、重現性及加標回收率均滿足分析要求。

白靈菇；熒光增白劑；高效液相色譜

前言

國家食品安全整頓辦發布的(2010)50號文件中，將熒光增白物質列入第四批“食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑”黑名單中。同時公布可能添加的食品品種有雙孢蘑菇、金針菇、白靈菇等[1]。其中，白靈菇又名雪山靈芝，營養豐富，含有氨基酸、無機鹽及維生素等，具有調節生理平衡、增強免疫力作用。

熒光增白劑除具有較好的增白作用外，還具有一定的保鮮、防腐功能，并非可食用型食品添加劑，嚴禁違法添加到食品中。目前，熒光增白劑檢測方法主要有紫外光燈照射法，紫外分光光度法[2]，熒光分光光度法[3-4]，高效液相色譜法[5-9]及液相色譜-質譜串聯法[10-13]等。

本研究采用高效液相色譜分析方法，以市面上最容易購買、價格低廉、增白效果明顯且常被檢出于其它樣品中的三種具有離解性質的陰離子型熒光增白劑VBL、CBS、CXT為檢測對象，以乙醇-水為提取溶劑，恒溫水浴靜置提取白靈菇中三種熒光增白劑，操作簡單，可行性較好，并應用該方法研究了白靈菇中熒光增白劑的提取條件。

1 實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

UltiMate 3000液相色譜(美國Thermo Fisher科技公司)、FA2104型電子天平、恒溫水浴箱，乙腈、甲醇(HPLC級)、乙酸銨(分析純)、無水乙醇(分析純)、熒光增白劑VBL(純度98%)、熒光增白劑CBS(純度99%)、熒光增白劑CXT(純度99%)，實驗用水為超純水，實驗用白靈菇購買于秦皇島市蔬菜市場，自制陽性樣品。

1.2標準溶液配制

準確稱取0.100 0 g熒光增白劑，用乙醇-水(V/V=1/2)溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成1.0 g/L的標準儲備溶液，于4 ℃冰箱中避光保存，備用。

1.3樣品前處理

稱取待測白靈菇樣品5.00 g于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL乙醇-水(V/V=1/2)溶液，50 ℃水浴靜置提取15 min，流水冷至室溫。取上述溶液過0.22 μm水相濾膜，供液相色譜儀測定。

1.4液相色譜條件

采用Thermo Fisher Accucore C18(250 mm×4.6 mm，2.6 μm)色譜柱；用乙酸銨(20 mmol/L)和乙腈作流動相，V(乙酸銨)∶V(乙腈)=65∶35；流速0.8 mL/min；激發波長350 nm，發射波長430 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。

2 結果與討論

2.1色譜圖

在最佳液相色譜運行條件下，3種熒光增白劑混合標準溶液的分離色譜圖見圖1。

圖1 3種熒光增白劑混合標準溶液的色譜圖Figure 1 Chromatogram of a standard mixture of the three FWAs.

2.2提取方式選擇

實驗采用水浴靜置、超聲波和空氣振蕩三種方式對白靈菇中3種熒光增白劑的提取效果進行比較，其中水浴靜置提取效果較好。三種提取方式比較見圖2。

圖2 三種提取方式比較圖Figure 2 Comparison of three extraction methods.

2.3提取時間和溫度的選擇

稱取陽性白靈菇試樣5.00 g于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL乙醇-水(V/V=1/2)溶液，50 ℃水浴靜置提取，探討不同提取時間(10、15、20、25 min)對白靈菇中3種熒光增白劑提取的影響。時間為15 min時達到最佳提取效果，15 min后隨著時間的延長，試樣中其它基質不斷析出，對目標物質造成影響。不同提取時間對3種熒光增白劑的影響見圖3。

圖3 時間對3種熒光增白劑的影響Figure 3 Effects of extraction times on three FWAs.

稱取陽性白靈菇試樣5.00 g于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL乙醇-水(V/V=1/2)溶液，分別于不同溫度(30、40、50、60 ℃)下水浴靜置提取15 min，探討最佳提取溫度。結果表明：溫度為50 ℃時提取效果最佳。提取溫度對3種熒光增白劑提取結果影響見圖4。

圖4 溫度對3種熒光增白劑的影響Figure 4 Effects of extraction temperatures on three FWAs.

2.4提取劑的選擇

保持其它條件不變，配制不同比例的乙醇:水溶液(V∶V=1/2、1/4、1/6及1/8，mL/mL)，反復實驗，當V乙醇∶V水=1∶2時，效果最佳。不同比例乙醇水溶液對3種熒光增白劑提取見圖5。

圖5 乙醇-水溶液對3種熒光增白劑的提取量Figure 5 Extraction amount of three FWAs with ethanol containing different concentration water.

2.5固液比的選擇

保持其它條件不變，不同固液比(5∶10、5∶20、5∶25、5∶30，g/mL)條件下提取，提取液分別定容于50 mL容量瓶中。當固液比為5∶20時，提取效果最佳。固液比例對3種熒光增白劑提取影響結果見圖6。

圖6 提取溶劑體積對3種熒光 增白劑的影響Figure 6 Effects of extraction solvent volumes on three FWAs.

2.6工作曲線和檢出限

適量移取三種熒光增白劑標準儲備溶液，配成熒光增白劑混合標準溶液，逐級稀釋，以熒光增白劑的色譜峰面積為縱坐標y(counts)，對應的濃度為橫坐標x(μg/mL)，進行線性回歸。得到3種熒光增白劑線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)見表1。

2.7方法加標回收和精密度實驗

加標回收實驗中選取3個添加水平，每個添加水平進行6次重復實驗，所得方法加標回收率及相對標準偏差(RSD)見表2。由表2可知，3種熒光增白劑的加標回收率在79%～90%，相對標準偏差在2.5%～4.3%，方法的準確度和精密度達到檢測白靈菇中熒光增白劑的要求。

表1 3種熒光增白劑的線性關系、儀器檢出限及方法定量限Table 1 Linear relationships，limits of detection and limits of quantification of the analytes/(μg·mL-1)

表2 3種熒光增白劑的加標回收率和精密度實驗Table 2 Recovery and precisions of the analytesspiked in a blank sample(n=6)

3 結論

建立了白靈菇中3種熒光增白劑的高效液相色譜分析方法，同時對提取條件進行研究，該方法簡單準確，線性關系、重現性及加標回收率均滿足分析要求。利用此方法進行了白靈菇中3種熒光增白劑的提取條件實驗，乙醇-水(V/V=1/2)溶液與50 ℃水浴靜置提取是效率較高的提取條件。

[1] 中華人民共和國衛生部. 關于公布食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第四批)[EB/OL].[2010-03].http//www.jdzx.net.cn/article/40288ce4062bb60401062bb60cef0015/2011/4/2c90948e2f8abdc1012f8b28d12f0006.html.

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DeterminationofFluorescentWhiteningAgentsinMushroombyHPLC

ZHANG Chunfang1，CAO Xiumei2，TONG Qi1*，YANG Weijun2，ZHANG Jianan2, YANG Zhaowei2

(1.HebeiKeyLaboratoryofAppliedChemistry，CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering,YanshanUniversity，Qinhuangdao,Hebei066004,China；2.QualitySafetySupervisionandInspectionCenterofAgriculturalProductinQinhuangdao，Qinhuangdao,Hebei066004,China)

A method for the determination of three fluorescent whitening agents (FWAs) (VBL, CBS, CXT) in mushroom by high performance liquid chromatography was developed. The sample was extracted with ethanol-water (V/V=1/2) solution by static extraction of water for 15 min at 50 ℃. The HPLC method was performed on a column of Thermo Fisher Accucore C18 (250 mm×4.6 mm, 2.6 μm) with elution using 20 mmol/L ammonium acetate (65%) and acetonitrile (35%) as the mobile phases with the flow rate of 0.8 mL/min. The target analytes showed good linearity in the range of 0.01—10 μg/mL with the correlation coefficients (r2) greater than 0.997. The recoveries were in the range between 79%—90%.

mushroom; fluorescent whitening agents(FWAs); high performance liquid chromatography(HPLC)

10.3969/j.issn.2095-1035.2017.03.002

O657.7+2；TH833

A

2095-1035(2017)03-0004-04

2017-03-01

2017-04-10

河北省高層次人才資助項目(A2016002037)資助

張春芳，女，在讀研究生，主要從事分析化學、色譜分析技術在食品及環境樣品檢測中的應用研究。E-mail: 18931902786@163.com

*通信作者：佟琦，女，副研究員，主要從事分析化學、色譜分析技術研究。E-mail: tongqi@ysu.edu.cn

本文引用格式：張春芳,曹秀梅,佟 琦,等. 高效液相色譜法測定白靈菇中熒光增白劑含量[J].中國無機分析化學,2017,7(3):4-7. ZHANG Chunfang，CAO Xiumei，TONG Qi,et al. Determination of Fluorescent Whitening Agents in Mushroom by HPLC [J].Chinese Journal of Inorganic Analytical Chemistry, 2017,7(3):4-7.