吡唑類活性物質XY-4陽離子脂質體的包封率測定研究

穆敏婕，陳換飛， 陳 婷， 段醒妹，張梅*

·炮制制劑·

吡唑類活性物質XY-4陽離子脂質體的包封率測定研究

穆敏婕1，陳換飛1， 陳 婷1， 段醒妹2*，張梅1*

目的：研究XY-4陽離子脂質體包封率的測定方法。方法：采用薄膜法制備XY-4陽離子脂質體；用超濾離心法分離脂質體和藥物，并用高效液相色譜法測定脂質體的包封率。結果：制得的脂質體包封率為84.6%；XY-4檢測濃度的線性范圍為20-100 μg．mL-1；平均回收率為99.8%。結論：本方法簡單、準確、重現性好，可用于XY-4陽離子脂質體的包封率的測定。

XY-4陽離子脂質體；包封率；高效液相色譜法

Aurora 激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括Aurora –A、Aurora –B和Aurora –C。其中Aurora-A激酶通常位于中心體和紡錘體上，由于對于牽引分裂中的染色體向兩極移動具有重要意義，常常被發現在多種腫瘤中表現出很強的活性，近年來作為抗腫瘤靶點受到人們的廣泛關注。我們前期以Aurora-A激酶為靶點，計算機藥物輔助設計為手段，設計并合成了一系列吡唑 [3,4-b] 吡啶類化合物，并發現了XY-4（結構如圖1所示）對多種不同組織來源的腫瘤細胞如結腸癌HCT-116細胞等具有抑制細胞增殖的作用[1]。但是XY-4不溶于水，影響了后期的進一步開發研究。藥物的溶解度是許多新藥研發中關注的首要問題，由于難溶于水，即使其飽和溶液也難以達到有效的治療濃度，所以改變藥物的溶解度對新藥的研發有著重要的意義[2]。我們將化合物XY-4制備成了一種陽離子脂質體，不僅解決了其水溶性問題，還由于陽離子脂質體的表面攜帶正電荷可以與帶負電荷的細胞膜通過靜電作用結合，更易為目標細胞攝取而發揮作用。

對于脂質體而言，包封率是評價脂質體制備和工藝的重要指標之一，也是脂質體能否發揮較普通制劑更高效、緩釋等優點的關鍵所在，它反映了被包裹在脂質體囊泡中的藥物占脂質體混懸液中藥物總量的比例[3]，因此建立一種科學合理、簡便易行的方法是很有必要的。

本文采用薄膜法制備出了XY-4陽離子脂質體，并參考文獻[3～8]，采用超濾離心法對其包封率進行測定。該法準確性高、重現性好，為XY-4陽離子脂質體的后續體內外進一步研究提供了保障。

圖1 XY-4 結構式

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統E2695及PDA檢測器（美國waters公司）；EYELA-1200A型旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社）；JA1003型電子天平（上海順宇恒平科學儀器有限公司）；高速離心機（賽默飛）；超濾離心管 （Millipore）

XY-4對照品及原料藥（實驗室自制，含量＞98%）；DOTAP（Avanti Polar Lipids, INC）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，所用超純水均為實驗室純水系統制備（Millipore）。

2 方法與結果

2.1 XY-4陽離子脂質體的制備

采用薄膜法制備XY-4陽離子脂質體。將DOTAP和XY-4按照質量比20:1完全溶解于適量三氯甲烷中，轉移到梨形瓶中，在55 ℃水浴條件下旋轉蒸發1 h，除去有機溶劑，在瓶壁形成一層薄膜后于真空干燥箱中過夜。加入超純水作為水相，55 ℃旋轉水化30 min，用超純水定容即得到一定濃度的XY-4陽離子脂質體。空白脂質體按照相同的方法制備。XY-4陽離子脂質體的平均粒徑在91.3 nm（見圖2）。

圖2 XY-4陽離子脂質體的粒徑分布圖

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（75:25）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為230 nm，進樣量為20 μL，柱溫設置為30 ℃。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的XY-4對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配得含XY-4 1.0 mg/mL的對照品溶液。

2.4 標準曲線的繪制

精密吸取相應體積的XY-4儲備液，分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻稀釋成濃度分別為100、90、80、60、40、20 μg/mL的對照品系列溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾后取續濾液進樣，按照上述色譜條件測定峰面積。以XY-4的檢測濃度（C）為橫坐標，以各濃度下測定的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=7093.9X-4606.5（r=0.9999）。結果表明，XY-4檢測濃度在20-100 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取濃度分別為0.025、0.05、0.100 mg/mL 的對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件重復進樣5次，測定峰面積。結果顯示，峰面積的RSD值分別為1.02%。表明該儀器精密度良好。

2.6 回收率試驗

精密量取濃度為1.0 mg/mL 的對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置于5 mL的容量瓶中，分別加入空白脂質體0.5 mL，用甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾后取續濾液進樣，按照上述色譜條件測定峰面積。結果表明，XY-4的平均回收率為99.8%，RSD=1.24%。

2.7 包封率測定

2.7.1 樣品的制備 取“2.1”項下制備的XY-4陽離子脂質體200 μL，加入2 mL甲醇溶液，超聲破壞3 min，經0.45 μm微孔濾膜過濾后作為工作液。按照“2.2”項下色譜條件進樣測定XY-4脂質體中的XY-4總含量。

將XY-4陽離子脂質體用超濾離心管在一定轉速下離心一定時間，取離心下的液體100 μL加入400 μL色譜甲醇溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，按照上述色譜條件進樣測定脂質體中游離XY-4的含量。根據以下公式計算XY-4陽離子脂質體的包封率：

2.7.2 不同超濾時間對包封率測定的影響 各取同一批XY-4陽離子脂質體0.5 mL置于超濾管中，4000 rpm．min-1分別離心5 min、10 min、20 min和30 min，測定濾液中游離的藥物量，計算包封率。結果見表1，離心時間在10 min之后測得的包封率基本無變化，所以超濾時間選擇為10 min。

表1 不同超濾時間測得包封率結果

2.7.3 不同超濾轉速對包封率的影響 各取同一批XY-4陽離子脂質體0.5 mL置于超濾管中，分別在4000、6000和8000 rpm．min-1超濾離心10 min，測定濾液中游離的藥物量，計算包封率。結果見表2，轉速在6000和8000 rpm．min-1時測得的包封率基本無變化，所以超濾轉速選擇為4000 rpm．min-1。

表2 不同超濾離心轉速測得包封率結果

2.7.4 超濾膜對藥物吸附性考察 精密移取XY-4對照品儲備液，用色譜甲醇稀釋成100、50、25 μg/mL三種濃度，各取0.5 mL于超濾離心管中，4000 rpm．min-1離心10 min，取濾液過0.45 μm微孔濾膜，按照上述色譜條件進樣測定XY-4含量，計算回收率。結果見表3，可認為超濾膜對XY-4無吸附。

表3 不同濃度XY-4溶液經超濾后的回收率結果

2.7.5 XY-4陽離子脂質體包封率的測定 選取同一批制備的XY-4陽離子脂質體按照“2.7.1”項下樣品處理方法處理后，采用HPLC在選定的色譜條件下測定XY-4的總含量，再用超濾離心法4000 rpm?min-1離心10min并處理后測定游離XY-4的量，計算包封率。結果測得的XY-4的平均包封率為84.6%。

3 討論

本實驗使用陽離子脂質DOTAP作為脂質層通過薄膜法制備了XY-4陽離子脂質體，得到的脂質體粒徑較小，分布均勻。包封率的測定中分離脂質和游離藥物的方法較多，主要包括葡聚糖凝膠法、透析法、超速離心法、離子交換樹脂法等。相比較葡聚糖凝膠法的操作復雜、耗時、藥物損耗較大。考慮到操作簡便準確、耗時短，可有效分離游離藥物和脂質體等優點，我們選擇了使用超濾離心法對制備的XY-4陽離子脂質體包封率進行測定。超濾法是在離心力作用下利用篩分原理對物質進行分離。

在測定包封率之前，我們首先建立了高效液相色譜法測定XY-4含量的方法，并考察了超濾離心的時間和轉速對包封率測定的影響，結果發現當轉速達到4000 rpm．min-1時，離心10 min測得的XY-4陽離子脂質體的包封率基本穩定不再變化，說明在該離心條件對包封率的測定較穩定。接著我們對超濾離心管對XY-4的吸附能力進行了考察，結果表明該型號的超濾離心管對XY-4的吸附＜1%，可認為對XY-4無吸附，不影響包封率的測定。

綜上所述，本實驗制備出了一種粒徑小且分布均勻的吡唑類活性物質XY-4陽離子脂質體，并建立了一種簡便準確、操作簡單易行的測定其包封率的方法，對后續深入研究具有重要意義。

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(責任編輯：傅舒)

Study on the encapsulation ef fi ciency of cationic liposome of pyrazole active substance XY-4 /

MU Min-jie1, CHEN Huanfei2, CHEN Ting2, DUAN Xing-mei2, ZHANG Mei1//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, Sichuan)

Objective:To study the method of determination of the entrapment efficiency of XY-4 cationic liposome.Method:XY-4 cationic liposome was prepared by fi lm method. Liposome and drug were separated by ultra fi ltration centrifugation,and the encapsulation efficiency of liposome was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).Result:The encapsulation ef fi ciency of liposome was 84.6%. The linear range of XY-4 was 20～100 μg．mL-1. And the average recovery was 99.8%.Conclusion:The method is simple, accurate and reproducible, and can be used for the determination of the encapsulation ef fi ciency of XY-4 cationic liposomes.

XY-4 cationic liposome; entrapment ef fi ciency; HPLC

R285.5

A

1674-926X(2017)03-007-03

1成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地 成都 611137；2 四川省醫學科學院?四川省人民醫院 成都 610072

穆敏婕（1992-），女，在讀碩士研究生

Tel:13540439524 Email:1552618356@qq.com

張梅，藥物分析教授

Tel:028-61800231 Email:zhangmei63@126.com段醒妹，藥劑學助理研究員

Tel:028-87393999 Email:2323272961@qq.com

2016-6-22