正交試驗法優選痛風顆粒水提工藝條件

施明毅，陳梓賢，李小芳，李建利,2*

正交試驗法優選痛風顆粒水提工藝條件

施明毅1，陳梓賢1，李小芳1，李建利1,2*

目的：正交試驗法優選痛風顆粒水提工藝條件。方法：采用高效液相色譜法測定綠原酸含量并進行方法學考察；以綠原酸含量及干浸膏收率為綜合評價指標，選取影響水溶性成分提取率的蒸餾水的量、煎煮提取時間及煎煮次數作為考察因素，應用L9(34)正交試驗設計選取最佳水提工藝條件。結果：最佳水提工藝條件為加8 倍量的水，煎煮3 次，每次1 h。結論：優選所得提取工藝條件穩定可行，可為痛風顆粒的工業生產提供試驗依據。

痛風顆粒；提取工藝；正交設計；綠原酸

1 材料

Agilent1100高效液相色譜儀（儀器包括：Agilent色譜工作站、VMD紫外檢查器，美國安捷倫公司）；DJ600-2型電子天平（成都倍塞克儀器表研究所）；FA1104N型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；KQ5200型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

金銀花、板藍根、防己、骨碎補、皂角刺、鹿銜草、膽南星、天竺黃、沒藥、薏苡仁等藥材（飲片），均購于四川省中藥飲片有限責任公司，經該公司檢驗科檢驗合格。綠原酸（批號：110753-200413，供含量測定用）購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

痛風顆粒處方為臨床上應用多年的祖傳經驗方，由金銀花、板藍根、骨碎補等多味中藥組成，具有除濕解毒、化瘀散結的功效，用于熱毒蘊結、痰濕凝滯所致的痛風性關節炎急性發作期。方中金銀花、板藍根等多味中藥富含水溶性有效成分，其中綠原酸為金銀花中重要的有效成分。本試驗根據各藥味的理化性質，通過水煎煮的試驗方法，以金銀花的有效成分綠原酸含量、干膏收率為考察指標

2 方法與結果

2.1 綠原酸含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 參照《中國藥典》2015年版一部“金銀花”項下綠原酸含量測定方法[1]進行試驗。色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250 mm），5 μm；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm；理論塔板數按綠原酸峰計算不低于1000。

2.1.2 對照品溶液制備及線性 取綠原酸對照品約5.09 mg，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含40.7 μg的溶液，即得。精密吸取上述溶液2、4、6、8、10、20 μL，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測定。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=3121.8962X+5.8821，r=0.9998。結果綠原酸進樣量在0.0814～0.8144 μg范圍內具有良好線性關系，標準曲線見圖1。

圖1 綠原酸標準曲線圖

2.1.3 供試品溶液制備及測定 按處方比例稱取經60 ℃干燥的金銀花、板藍根等藥材（飲片）適量，平行9份，按正交試驗設計表進行提取，將藥液濾過，合并后放冷，定容至250 mL，精密吸取藥液各2 mL于蒸發皿中，40 ℃蒸干，殘渣加50%甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定，結果見表2。

2.1.4 陰性對照溶液的制備及專屬性 按處方比例稱取經60 ℃干燥的除金銀花以外的其他藥材（飲片），照供試品溶液制備方法制備，即得。精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定。結果陰性對照溶液在327 nm處無干擾，見圖2。

圖2 綠原酸對照品溶液（A)、供試品溶液（B）、陰性對照溶液（C) HPLC圖譜

2.2 干膏收率測定

精密吸取“2.1.3”項下定容后的供試品提取液各20 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱重，計算干膏收率。

2.3 正交試驗設計及結果

查閱文獻[2～6]，水煎煮工藝中，影響水煎煮提取效果主要因素有：加水量、煎煮時間、煎煮次數。本次試驗在預試驗的基礎上，結合處方藥物理化性質及臨床療程，以綠原酸含量及干浸膏收率（權重系數分別為0.8和0.2）為綜合評價指標，按處方比例稱取經60 ℃干燥的金銀花、板藍根等藥材（飲片）適量，共9 份，進行L9(34)正交試驗優化提取工藝。因素水平和試驗安排結果見表1、2 ，方差分析結果見表3。

表1 痛風顆粒水煎煮工藝正交試驗因素水平表

表2 痛風顆粒水煎煮工藝正交試驗結果表

注：綠原酸含量評分=綠原酸含量/最大綠原酸含量×100×0.8；干膏收率評分=干膏收率/最大干膏收率×100×0.2；綜合評分=綠原酸含量評分+干膏收率評分

表3 痛風顆粒水煎煮工藝正交試驗方差分析表

結果表明，影響水提取綜合得分的各因素作用的大小為A＞B＞C，A因素有顯著性差異，B和C因素沒有顯著性差異，綜合直觀分析和方差分析結果，結合工業化生產需要考慮，確定最佳提取工藝為A3B2C2，即加8倍量水，煎煮3次，每次1小時。

2.4 驗證試驗

按處方比例稱取經60 ℃干燥的金銀花等藥材（飲片），平行3份，按篩選的最佳提取工藝條件提取，結果綠原酸的平均含量為8.439 mg/g，RSD為1.06%，干膏平均收率為24.98%，RSD為0.97%，說明優選所得的提取工藝條件穩定性良好。見表4。

表4 痛風顆粒水煎煮工藝正交試驗驗證結果表

3 討論

痛風顆粒處方來源于名老中醫經驗方，其經驗方為湯劑和散劑用于臨床，結合處方中藥味的有效成分與現代藥理研究，水提工藝開始設計為采用水煎煮提取金銀花、板藍根等藥味，方中天竺黃、膽南星等兩味中藥材粉碎成細粉在制劑成型工藝中與干膏細粉和輔料進行混合，以便更好的發揮療效。但通過預試驗發現，二者混合粉碎時容易在粉碎過程中發熱粘連成塊，增大粉碎難度，影響粉碎效果。考慮到工業生產的可行性，故在后續工藝考察中，直接加入到水煎煮提取工藝中。

金銀花為君藥之一，與處方的解毒散結功能相關，而綠原酸又為其金銀花的主要有效成分之一；防己作為方中佐藥，與其祛濕功能相關，且防己諾林堿與粉防己堿常作為評價防己藥材含量的指標，故以綠原酸、防己諾林堿和干膏收率作為指標性成分考察，但在含量測定的過程中，因復方中防己藥材處方量相對較少以及提取過程的損耗，造成防己諾林堿的含量相對偏低，不宜進行含量測定，故最終確定綠原酸和干膏收率為綜合指標進行工藝篩選。綠原酸含量測定流動相預試驗，比較乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）、乙腈-0.4%磷酸溶液（12:88）和乙腈-0.4%磷酸溶液（20:80），試驗結果乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）效果更好，故選擇此流動相作為測定綠原酸含量。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 一部[S]. 北京：中國醫藥科技出版社，2015：221.

[2] 施明毅，李建利，謝燕，等. 正交試驗法優選冠心康膠囊水提工藝條件[J]. 成都中醫藥大學學報，2013，36（1）：55-57,93.

[3] 陶德林.正交法優選復方骨碎補接骨片提取工藝的研究[J].中國現代應用藥學,2010,27(5):409-411.

[4] 鄭平原,胡詠華,蔣麗,等.正交試驗優選復肝寧膠囊提取工藝[J].湖南中醫藥大學學報,2011,31(7):35-37.

[5] 劉鋼,張平,夏泉.正交試驗法優選金銀花的提取工藝研究[J].海峽藥學.2012,24(8):17-19

[6] 俞穎,鄭東升,饒躍峰.復方鹿銜草顆粒制備工藝的研究[J].中國醫藥指南.2012,10(10):4-5.

(責任編輯：傅舒)

Optimization of extraction process with water of Tongfeng granule by orthogonal design/

SHI Ming-yi1, CHEN Zi-xian1,LI Xiao-fang1, LI Jian-li1,2//(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 611137, Sichuan; 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To optimize the extraction condition with water of Tongfeng granule by orthogonal design.Method:The measurement method of chlorogenic acid was detected by HPLC. The optimum extraction conditions were investigated by the L9(34) orthogonal design. The content of chlorogenic acid and dry extract yield were used as comprehensive evaluation indexes.The water amount, the extraction time and the extraction times were used as factors.Result:The optimal conditions were as follows: the raw materials were extracted three times with 8 times of water for 1 h.Conclusion:This optimized process is stable and feasible. It can provide test basis for industrial production of Tongfeng granule.

Tongfeng granule; extraction process; orthogonal design; chlorogenic acid進行綜合評分，采用正交試驗設計優選痛風顆粒最佳水提工藝條件，建立合理有效的提取方法，提高制劑的工藝水平。

R 283.6

A

1674-926X(2017)03-009-03

四川省教育廳重點項目（152A0094）；四川省科學技術廳科技成果支撐項目（08-2-242）

1成都中醫藥大學，成都市 611137；2四川省中醫藥科學院中醫研究所，成都市 610031

施明毅（1984年12月-），男，醫學碩士，助教，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術，中藥信息化研究。

Tel:15828507258 Email:thj125smy1222@163.com

李建利（1957年10月-），男，教授，碩士研究生導師，主任藥師，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術研究。

Tel:15902833306 Email:menguan1005@163.com

2016-12-5