明膠海綿復合生長因子加速頜骨骨折愈合的實驗研究

唐彥峰 陳建霖 周云彪

明膠海綿復合生長因子加速頜骨骨折愈合的實驗研究

唐彥峰1陳建霖2周云彪1

1.包頭市中心醫院口腔頜面外科，包頭 014040；2.靈武市人民醫院口腔科，靈武 750400

目的 探索明膠海綿復合生長因子緩釋系統加速頜骨骨折愈合的作用和機制，為臨床加速頜骨骨折愈合提供新的方法。方法 按每100 μg基因重組人骨形態發生蛋白（BMP）-2用1 mL重組牛堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）液完全溶解后，取40 μL滴加到明膠海綿（0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm）組織塊中，凍干后制成bFGF/BMP/明膠海綿緩釋系統。在12只新西蘭大白兔兩側下頜制造線樣骨折，左側為對照組，只用鈦板固定；右側為實驗組，鈦板下放置bFGF/BMP/明膠海綿。術后2、4、12周行大體觀察、X線檢查、組織學檢查。結果 術后2周，實驗組較對照組在骨折斷端處可見更多纖維組織長入；術后4周，實驗組骨折間隙可見到纖維性骨痂，對照組可見纖維組織和血管長入；12周后實驗組和對照組骨折均已完全愈合。結論 bFGF/BMP/明膠海綿能加速骨折愈合，提高骨折愈合效果。

頜骨； 骨折愈合； 堿性成纖維細胞生長因子； 骨形態發生蛋白-2； 明膠海綿

頜面部骨折會給人的外觀、功能和心理造成重大打擊，嚴重影響患者正常生活和工作。現有的骨折治療方法，骨折愈合過程均需3～6個月，加速頜面部骨折愈合已成為研究的熱點。隨著骨折愈合機制研究的深入，發現生長因子能加速骨折愈合過程，但生長因子局部注射易吸收和降解，難以持久地發揮加速骨折愈合的作用。隨著生物材料學的發展，生長因子和生物支架材料復合的緩釋系統應運而生。這種緩釋系統可在骨折局部緩慢釋放生長，并使之持久作用[1]。本研究將明膠海綿復合骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）制成緩釋系統，使其作用于兔下頜骨骨折部位，觀察骨折愈合過程，以明確其臨床應用前景。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

基因重組人BMP-2凍干粉（北京中科物源生物技術有限公司），重組牛bFGF液（珠海億勝生物制藥有限公司），明膠海綿（金陵藥業股份有限公司），鈦板（鄭州康德鈦制品科技有限公司），組織學切片機（Leica 公司，德國），光學顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.2 bFGF/BMP/明膠海綿緩釋系統的制備

在超凈工作臺內按每100 μg BMP-2用1 mL bFGF液完全溶解后，用50 μL移液器移出40 μL，滴加到明膠海綿（0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm）組織塊中，置于-70 ℃冷凍干燥機內快速凍干，制成bFGF/BMP/明膠海綿緩釋系統，環氧乙烷消毒，4 ℃保存備用。

1.3 動物實驗

健康成年新西蘭大耳白兔，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供， 重2.5～2.7 kg，共12只。按30 mg·kg-1戊巴比妥鈉給予兔耳緣靜脈注射麻醉，在其雙側下頜制造線樣骨折，并用鈦板固定骨折部位。左側為對照組，只用鈦板固定；右側為實驗組，鈦板下放置bFGF/BMP/明膠海綿。術后2、4、12周處死動物。直接取出雙側下頜骨，不剝離骨折端處骨膜，4%甲醛固定1周。

1.4 大體觀察

觀察動物術后飲食情況及術區創口反應；處死動物后，肉眼觀察下頜骨骨折部位及周圍軟組織的生長情況。

1.5 X線檢查

對固定后的雙側下頜骨行X線攝片，觀察骨折部位的愈合情況。拍攝距離為60 cm，電壓為42 kV，電流100 mA，曝光時間0.05 s。

1.6 組織學檢查

將固定后的標本放置在30%EDTA中脫鈣2周，中途更換脫鈣液1次，逐級乙醇脫水，浸蠟，包埋，切片厚度5 μm，進行蘇木精-伊紅染色和觀察。

2 結果

2.1 大體觀察

術后所有動物生命體征平穩，體重逐漸增加，術區無紅腫、化膿，手術創口均為一期愈合，無1例感染，均存活至預定取材時間。

術后2周，對照組骨折處可見少量新生軟組織形成，骨折處活動度較大；實驗組骨折處可見較多新生軟組織，骨折斷端可活動，骨折表面可見軟組織覆蓋。術后4周，對照組骨折處可見新生軟組織存在，骨折下緣可見少量的骨痂形成，骨折斷端活動度減小；實驗組骨折表面和下緣可見較多骨痂形成，骨折斷端未見明顯骨折動度。術后12周，對照組骨折處有明顯骨痂，骨折無動度，原骨折線可見線樣凹陷；實驗組骨折已愈合，骨痂明顯，骨折無動度，骨折線已消失。

2.2 X線檢查

X線檢查結果見圖1。

圖1 2組術后X線檢查Fig 1 Postoperative X-ray of two groups

術后2周，2組均可見明顯的骨折線。術后4周，對照組骨折斷端下緣模糊，下頜下緣可見有骨痂形成；實驗組骨折斷端邊緣模糊，下頜下緣可見有骨痂形成。術后12周，2組骨折愈合良好，無明顯骨折線。

2.3 組織學檢查

2組術后組織學觀察結果見圖2。術后2周，對照組骨折斷端明顯，骨折端可見少量的纖維組織，骨折縫隙內未見纖維組織長入；實驗組骨折斷端處可見大量的纖維組織，未見到破骨細胞和成骨細胞存在。術后4周，對照組骨折斷端內可見大量纖維組織和血管長入，可見到少量的破骨細胞和成骨細胞，骨折兩側可見骨吸收和成骨活動；實驗組骨折邊緣可見少量間斷纖維性骨痂，靠近骨折中心處仍可見纖維組織存在。術后12周，2組骨折處都已骨性愈合，對照組骨折間隙處骨小梁排列方向與周圍骨組織不同；實驗組骨小梁方向與周圍骨組織方向基本一致。

圖2 2組術后組織學觀察 蘇木精-伊紅染色 × 100Fig 2 Postoperative histologic observation of two groups hematoxylin-eosin stain × 100

3 討論

隨著社會的發展，頜面部骨折呈逐年上升趨勢。因為骨折的愈合期較長，嚴重影響患者的正常生活，所以頜面部骨折的治療成為當今研究的熱點問題。在骨創傷愈合過程中，大量骨生長因子的協同作用促進骨折的愈合。其中，BMP和bFGF在骨形成過程中起著至關重要的作用。

BMP與誘導原始細胞分化為能形成軟骨樣和骨樣組織的細胞有關。BMP對軟骨細胞和成骨細胞的生長、分化和凋亡有著重要的調節作用，可促進軟骨和骨組織形成[2-3]。研究表明，BMP-2在骨形成、骨重建和骨修復中起重要作用[4-5]，能刺激骨髓間充質干細胞的分化[6]，并可以通過增加骨涎蛋白表達來促進下頜缺損的骨形成[7]。成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）是關節軟骨細胞最明顯的有絲分裂原，可以促進毛細血管向骨折段長入，加速軟骨細胞的增殖、分化、成熟[8-9]。bFGF可以刺激成骨細胞內骨鈣素增加，加快骨的礦化，加快新骨形成。實驗研究表明，FGF-2是骨形成的重要調節因子[10]，能加速骨祖細胞的增殖[11]，用FGF-2治療動物腓骨骨折組的骨痂量、成骨細胞指數均較對照組有明顯增加，最大負荷、最大彎曲強度和最大能量吸收也明顯增加[12]。

明膠海綿是一種無毒、無抗原性的蛋白膠類物質，有良好的可壓縮性、可吸收性和遇水再膨脹性，無毒副作用，主要用于創面止血。在生產過程中使用氮氣使其呈現多孔樣結構，極大地增加了對藥物的吸收量。另外，明膠可以通過表面與細胞的接觸促進細胞的黏附和增殖[13]。明膠海綿在組織中完全吸收需要4～6周。基于這些原因，明膠海綿可作為緩釋系統的載體。

目前，復合生長因子和生物支架材料的緩釋系統在骨折愈合的研究中愈來愈受到重視。本實驗將明膠海綿復合BMP/bFGF制成緩釋系統，使其作用于兔下頜骨骨折部位，術后實驗組和對照組均未見感染和排異反應，可見明膠海綿有較好的生物相容性和臨床應用性；通過與對照組進行大體觀察、X線及組織學檢查對比發現，術后實驗組較早地有纖維肉芽組織長入骨折斷端，骨痂形成也明顯早于對照組。這表明實驗組能明顯加速骨折愈合。其原因是明膠海綿在術后較長時間內可通過緩慢釋放BMP和bFGF，使其在局部持續維持較長時間的藥物濃度；也能在骨折局部起到膜引導骨再生作用，減少局部纖維組織長入骨折線內，避免和減少了影響骨折愈合的不利因素，從而能發揮出更好的加速骨折愈合作用。

綜上所述，BMP/bFGF/明膠海綿緩釋系統能夠在骨折早期緩慢釋放生長因子，加速骨折的愈合過程，且具有較好的生物相容性，因此，BMP/bFGF/明膠海綿緩釋系統在臨床骨折治療中具有較好的應用前景。

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（本文編輯 李彩）

Experimental study on accelerated healing of jaw fracture using gelatin sponge compound growth factor

Tang Yanfeng1, Chen Jianlin2, Zhou Yunbiao1.
(1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Baotou Central Hospital, Baotou 014040,China; 2. Dept. of Stomatology, Lingwu People’s Hospital, Lingwu 750400, China)
Supported by: Science and Technology Development Programs of Yinchuan, Ningxia Province (2008061). Correspondence:Zhou Yunbiao, E-mail: 13171208970@163.com.

Objective To explore the role and mechanism of drug delivery systems using growth factor combined with gelatin sponge on accelerating the healing of jaw fracture and to seek better treatment of accelerating the maxillofacial fracture.Methods About 100 μg recombinant human bone morphogenetic protein (BMP)-2 was completely dissolved in 1 mL recombinant bovine basic fibroblast growth factor (bFGF), and the solution (40 μL) was dropped in gelatin sponge (0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm). Then, it was freeze dried and prepared into bFGF/BMP/gelatin sponge delivery systems. The mandibular fracture model on two sides were prepared in 12 New Zealand rabbits and randomly divided into two groups. The left side was the control group, which was only fixed with titanium plates. The right side was the experimental group, in which bFGF/BMP/gelatin sponge delivery systems were put under the titanium plates. General observation, X-ray, and histological examination were taken at 2, 4, and 12 weeks after surgery. Results After 2 weeks, more fibrous tissues were seen between the fracture ends in the experimental group than in the control group. After 4 weeks, fibrous fracture callus were seen in the fracture gap in the experimental group. The ingrowths of fibrous tissue and blood vessels were seen in the control group. The fracture healing of the experimental group was significantly faster than the control group at 2 and 4 weeks. After 12 weeks, the experimental and control groups all healed completely. Conclusion bFGF/BMP/gelatin sponge can accelerate and improve fracture healing;thus, it has better clinical application prospect.

jaw; fracture healing; basic fibroblast growth factor; bone morphogenetic protein-2; gelatin sponge

R 782.4

A

10.7518/hxkq.2017.05.012

2016-12-08；

2017-03-09

寧夏銀川市科技攻關課題（2008061）

唐彥峰，主治醫師，碩士，E-mail：tyf1983@sina.com

周云彪，副主任醫師，E-mail：13171208970@163.com