滇紅食用玫瑰生根培養基的試驗篩選研究

李曉亮，張軍云 *，張 鐘，董春富，楊世先，王文智，張建康，張翠萍

(1. 玉溪市農業科學院，云南 玉溪 653100；2. 通海錦海農業科技發展有限公司，云南 通海 652700)

滇紅食用玫瑰生根培養基的試驗篩選研究

李曉亮1，張軍云1 *，張 鐘1，董春富2，楊世先1，王文智1，張建康1，張翠萍1

(1. 玉溪市農業科學院，云南 玉溪 653100；2. 通海錦海農業科技發展有限公司，云南 通海 652700)

利用植物組織培養快繁技術可以解決食用玫瑰傳統種苗繁育所存在的瓶頸，但長期以來瓶內生根困難是包括食用玫瑰在內的大多數木本植物組織培養面臨的最大技術障礙。為此，采用“L16(45)正交試驗和追加試驗”的方法，開展了52組滇紅食用玫瑰瓶內生根試驗，研究基礎培養基、6-BA等6種因素對生根的影響，分析篩選出適宜生根的培養基。結果表明,不同試驗處理間滇紅食用玫瑰分化生長和生根的差異較大；玫瑰莖段成株率和植株生根率主要受到激素的控制，植株的根發生主要有4種方式；生根的適宜培養基是1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA1.0 mg/L+AC0.1 %或1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA1.0 mg/L+AC0.1 %，他們的莖段成株率分別為92.86 %和93.33 %，植株生根率分別為95.38 %和96.43 %，生根方式均為根從莖段的基部發出且基部無愈傷組織，根系發育良好，植株整齊、葉綠、生長茂盛。該結果可應用于滇紅食用玫瑰工廠化組織培養育苗。

食用玫瑰；組織培養；瓶內生根；培養基；正交試驗

食用玫瑰為薔薇科薔薇屬，原產中國。目前不僅中國廣泛栽培，日本、朝鮮、及歐、美各國亦有大量栽培。玫瑰花香味純正，產油量高，可用于食品、飲料、化妝品、保健品、藥品等眾多方面。食用玫瑰集藥用、食用、香化、綠化于一體，種植效益好，發展前景十分廣闊[1]。

近年來，我國食用玫瑰產業發展迅速，已形成一定的產業規模。僅山東平陰，食用玫瑰的栽培就超過1300 hm2，甘肅苦水及新疆建設兵團農八師也有大面積的種植[2]。在云南，食用玫瑰的種植面積達到4666.7 hm2，成為中國乃至亞洲的主產區[3]。據市場調查，中國藥用、食用、酒用、化工及出口玫瑰花年需30萬t以上，而年產量卻只有幾萬t，市場預測短期內(10年內)全國食用玫瑰的產量將供不應求[4]。

種苗是食用玫瑰生產的一個重要前提。目前食用玫瑰主要是采取扦插、嫁接、壓條等傳統的種苗繁育方法[1-2]，其缺點是繁殖系數低、速度慢、周期長、變異大、病害傳播嚴重、品質差、成本高等，成為了食用玫瑰種苗供應的瓶頸，直接影響食用玫瑰的生產能力和市場競爭力。

植物組織培養技術具有繁殖速度快，整齊度高，且不受地理環境和季節的限制、遺傳背景一致、生長周期短、成本低等諸多優點[5-6]，可以用于大量繁殖緊缺和常規繁殖方法難于繁殖的植物，并已有大量成功的實例[7]。因此，利用植物組織培養技術繁育食用玫瑰種苗，是解決傳統種苗繁育瓶頸的一種重要技術途徑，對促進食用玫瑰種苗生產具有重要意義。

長期以來，瓶內生根困難是木本植物組織培養最大的技術障礙[7-9]。近年來，一種新的組培苗生根技術(瓶外生根)應運而生[10-12]，在一些植物上已有研究報道，如歐李[13]、黃金槐[14]、藍莓[15]等。然而，瓶外生根技術對外界環境條件要求十分嚴格，光、溫、濕等微環境不易調控[15]，存在著易受環境波動影響、占用空間大、難以大批量工廠化操作等諸多問題。玫瑰組織培養相比其他植物組織培養起步晚，歷時短，諸如培養基選擇和提高增殖速度等很多技術問題尚未清楚[16]，玫瑰組織培養的研究報道較少[17-18]。

為此，本研究開展滇紅食用玫瑰瓶內生根試驗研究，旨在分析探索不同因素對生根的影響，篩選出適宜生根的培養基，解決食用玫瑰瓶內生根困難的問題，為食用玫瑰工廠化組織培養育苗提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

于2014年9月至2015年2月在玉溪市農業科學院組培室實施試驗。

1.2 試驗材料

采用玉溪市農業科學院組培室培養的無菌滇紅食用玫瑰植株作為供試材料。

1.3 試驗設計

以基礎培養基、6-BA、NAA、IBA、IAA為5種主要因素，各4水平，采用L16(45)正交表設計正交試驗，共16組試驗處理。根據試驗情況，分析比較后，對各因素作調整，主要采用對比法設計追加試驗，直到篩選到合適的培養基時試驗結束，共涉及試驗處理52組，每組處理接種15瓶。

表1 滇紅食用玫瑰生根培養基的試驗設計

續表1 Continued table 1

1.4 試驗方法

為保證試驗的均勻性，接種操作時均選擇生長相對一致、高大筆直的無菌植株。將無菌植株切成單腋芽的莖段，接種到每個處理的培養基中，每瓶接種5段，培養30～35 d后立即開展試驗調查。

所有培養基含瓊脂(強度900 g/cm2)5.5 g/L，白砂糖(GB317)30 g/L，pH 5.6～5.8。培養基經121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。培養室溫度(25±2) ℃，濕度30 %～45 %，日光燈照明，光照強度2000～3000 lx，光照時間12 h/d。

1.5 試驗調查和數據統計

調查內容：每個處理的瓶數、成株數、生根的植株數、株高、植株生根量、根長、生長情況。

當調查株高、植株生根量和根長時，均分別在各自所有樣本中隨機取樣調查5個樣本，若樣本量不足5，則以實際樣本調查。

成株率( %)=成株數/莖段數×100

植株生根率( %)=生根的植株數/成株數×100

對采用L16(45)正交試驗設計的1～16處理進行莖段成株率和植株生根率的極差分析。

采用Excel 2003和SPSS 16.0處理和分析數據。

2 結果與分析

2.1 成株率

滇紅食用玫瑰莖段接種到不同處理的培養基中，分化形成植株的差異較大(表2)。莖段成株率變化范圍為0～93.33 %。其中，成株率0～60.00 %的處理占63.46 %；成株率61.00 %～79.00 %的處理占19.23 %；成株率80.00 %～89.50 %的處理占11.54 %；成株率≥90.00 %僅有3個處理，只占5.77 %，3個處理是處理29、47、50，其成株率分別為90.00 %、92.86 %、93.33 %。

2.2 植株的生根率

滇紅食用玫瑰植株生根率不同處理間差異較大，變化范圍為17.86 %～100.00 %(表2)。其中，生根率17.86 %～60.00 %的處理占22.92 %；生根率60.50 %～79.00 %的處理占22.92 %；生根率80.00 %～89.00 %的處理占16.67 %；生根率≥90.00 %處理占37.50 %，分別是處理39(90.00 %)、26(90.91 %)、45(92.00 %)、20(92.31 %)、19(93.10 %)、14(93.33 %)、17(95.12 %)、47(95.38 %)、50(96.43 %)、43(97.14 %)。生根率為100.00 %的處理有8個，分別是處理3、4、5、9、10、15、30、40。

2.3 株高

滇紅食用玫瑰株高不同處理間差異較大，變化范圍為1.60～6.66 cm(表2)。其中，株高1.60～2.90 cm的處理占33.33 %；株高3.00～3.99 cm的處理占37.50 %；株高4.00～4.99 cm的處理占12.50 %；株高5.00～5.90 cm的處理占10.42 %；株高>6.00 cm的處理有3個，占6.25 %，為處理6、12、11，其株高分別為(6.22±0.70)、(6.28±0.09)、(6.66±0.14)cm。

2.4 植株生根量

滇紅食用玫瑰植株生根量不同處理間差異較大，變化范圍為1.20～8.60條(表2)。其中，生根量1.20～2.90條的處理占33.33 %；生根量3.00～4.90條的處理占37.50 %；生根量5.00～6.90條的處理占16.67 %；生根量7.00～8.60條的處理有6個，占12.50 %，為處理50、10、39、8、42、20，其植株生根量分別為(7.00±0.32)、(7.00±0.71)、(7.00±1.22)、(7.67±1.86)、(8.20±1.16)、(8.60±0.51)條。

2.5 根長

滇紅食用玫瑰植株根長不同處理間差異較大，變化范圍為0.40～11.60 cm(表2)。其中，根長0.40～0.99 cm的處理占25.00 %；根長1.00～1.99cm的處理占31.25 %；根長2.00～3.99 cm的處理占25.00 %；根長4.00～4.90 cm的處理占10.42 %；根長>5.00 cm的處理有4個，占8.33 %，是處理3、1、9、10，其根長分別為(8.50±1.61)、(9.00±2.30)、(9.60±0.68)、(11.60±1.08)cm。

表2 不同處理對滇紅食用玫瑰生根的影響

續表2 Continued table 2

注：表中數據為平均值±標準誤。

Note: Values were means±SE.

表3 不同因素對滇紅食用玫瑰莖段成株率和植株生根率影響的極差分析

2.6 植株生根方式

滇紅食用玫瑰植株的生根方式差異較大(表2)，主要包括4種方式：根從基部發出，基部無愈傷組織(占35.42 %)；根從基部發出，基部無或附少量甚至微量愈傷組織(占14.58 %)；根從基部的愈傷組織發出，基部愈傷組織多寡不一(占47.92 %)；根從基部或基部少量愈傷組織發出(占2.08 %)。

2.7 不同因素對玫瑰生根的影響

莖段成株率極差分析(表3)表明，因素影響的主次關系為：NAA>IBA>6-BA>IAA>基礎培養基，可見滇紅食用玫瑰莖段分化成植株主要是受到激素的影響，NAA影響最大。從各因素的水平和水平均值(表3)可以看出：隨NAA水平的上升，成株率呈下降趨勢；隨IBA水平的上升，成株率呈現出先增后降的趨勢；隨6-BA水平的上升，成株率呈下降趨勢；隨IAA水平的上升，成株率呈增加趨勢；隨基礎培養基水平的上升，各水平間的成株率差異不明顯。因此，莖段成株率水平均值較大時的各因素應取水平是：NAA 0 mg/L，IBA 0～0.5 mg/L，6-BA 0～0.5 mg/L，IAA 0～2.0 mg/L，基礎培養基MS或WPM或1/2MS或1/4MS。

植株生根率極差分析(表3)表明，因素影響的主次關系為：IBA>6-BA>IAA> NAA>基礎培養基，可見滇紅食用玫瑰植株生根主要是受到激素的影響，IBA影響最大。從各因素的水平和水平均值(表3)可以看出：隨IBA水平上升，生根率呈現出先降后增的趨勢；隨6-BA水平上升，生根率呈降低趨勢；隨IAA水平上升，生根率呈先降后增的趨勢；隨NAA水平上升，生根率呈增加的趨勢；隨基礎培養基水平的上升，生根率有下降趨勢，但水平間差異不明顯。因此，植株生根率水平均值較大時的各因素應取水平是：IBA 0～2.0 mg/L，6-BA 0～0.5 mg/L，IAA 0或2.0 mg/L，NAA 0～2.0 mg/L，基礎培養基MS或WPM或1/2MS或1/4MS。

在處理21和22、處理24和25的兩組對比試驗中(表1～2)，培養基中沒有加入AC時(處理22、25)，植株基部均有愈傷組織，特別是處理25的植株基部有大量愈傷組織，根部分褐化呈黑色，而加了AC后(處理21、24)，植株基部均無愈傷組織，根為白色，而且極大地提高了植株的生根量，處理24的植株生根量明顯大于處理25，其生根量分別為(4.60±0.81)、(1.40±0.24)條。由此可見，AC對滇紅食用玫瑰生根有明顯影響，AC是玫瑰生根培養基的必需成分。

綜合考慮各因素對生根的影響(表1～3)，各因素用于滇紅食用玫瑰生根時適合考慮選取的范圍是：MS或WPM或1/2MS或1/4MS+6-BA 0～0.5 mg/L+NAA 0 mg/L+IBA 0～0.5 mg/L +IAA 0～2.0 mg/L+AC0.1 %。

2.8 適宜生根培養基的選擇

根據不同因素對滇紅食用玫瑰生根的影響規律(表1～3)，對各因素及其水平調整后進行追加試驗，綜合分析各試驗處理的莖段成株率、植株生根率、根的發生方式以及植株生長情況(表1～2)，結果表明，滇紅食用玫瑰生根的適宜培養基是處理471/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+AC0.1 %)或處理50(1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+AC0.1 %)，其莖段成株率分別為92.86 %、93.33 %，植株生根率分別為95.38 %、96.43 %，生根方式均為從基部發出且基部無愈傷組織、根系發育良好。但是，處理47中有少量植株枯死(1.54 %～3.08 %)，而處理50無植株死亡現象發生，且處理50的植株生根量(7.00±0.32條)和根長(1.44±0.10 cm)均大于處理47(5.00±0.71條、0.66±0.11 cm)。因此，滇紅食用玫瑰生根的最佳培養基是處理50(1/2MS+6-BA2.0 mg/L+IBA1.0 mg/L+AC0.1 %)。

3 討 論

植物組織培養中涉及生根的主要影響因素有基礎培養基類型、基礎培養基的元素養分組成、6-BA、NAA、IBA、IAA、AC等，加之各因素對應不同的水平，導致處理組合數(培養基)特別多。對生根困難的木本植物而言，要從較多數目的處理中尋找到適合的生根培養基，顯得繁瑣復雜，工作量巨大。從而，很多人寧肯嘗試瓶外生根技術[13-15]，也不愿意花大力氣去尋找生根培養基。本研究先正交試驗，根據生根試驗情況(表1～2)，分析出各因素適合選取的水平范圍(表3)，據此范圍再對各因素對比調整追加試驗(表1～2)，直到找到適合生根的培養基為止，共試驗52組獲得成功，工作量屬于可以接受的范圍。這種研究方法，為生根困難的植物(特別是木本植物)尋找適宜生根培養基提供了一個重要的參考范例。

植物激素在植物組織培養的生根過程中起著重要作用[6]。本研究也表明，激素對滇紅食用玫瑰的生根產生了重要影響(表3)。NAA、IBA是組織培養中常用的生長素，作用主要是促進植物細胞分裂和根的分化，6-BA是組織培養中常用的細胞分裂素，作用主要與細胞分裂、頂端優勢改變和芽的分化等有關[6]， NAA、IBA、6-BA對不同植物組織培養的具體影響會有差異。為分析NAA、IBA和6-BA對滇紅食用玫瑰生根的具體影響，避免因素間的交互效應，在追加試驗中分別對NAA、IBA、6-BA單獨設置梯度變化試驗(表1～2)，結果表明：在處理42、26、27、28、23中，隨著NAA濃度逐步加大(0～3.0 mg/L)，基部愈傷組織由無逐漸增多，莖段成株率和植株生根率也逐漸降低，特別是當NAA濃度為3.0 mg/L時(處理23)，莖段大量愈傷化致不能分化形成植株；在處理42、29、33、37中，隨著IBA濃度逐步加大(0～2.0 mg/L)，基部愈傷組織的量由無變化到少量，莖段成株率和植株生根率表現出先增后降的趨勢；在處理47、49、50中，隨著6-BA濃度逐步加大(0.5～2.0 mg/L)，基部仍無愈傷組織，莖段成株率和植株生根率表現出先降后增的趨勢；同樣，追加試驗中對基礎培養基單獨設置梯度變化試驗(表1～2)，在處理42、43、45中，不同的基礎培養基對滇紅食用玫瑰的生根影響差異不明顯。由此說明，單獨對激素和基礎培養基設置梯度追加試驗的結果與正交試驗結果接近(表3)，表明NAA、IBA、6-BA 和基礎培養基等因素之間的交互作用對滇紅食用玫瑰生根的影響不大。

AC是植物組織培養中一種重要的培養基成分。有研究表明，AC可以促進器官發生，形成根或芽[6]。本試驗發現AC在滇紅食用玫瑰生根中發揮了重要作用，其可以抑制玫瑰植株基部的愈傷組織化，極大地促進植株生根，減少根的褐化程度，這可能主要是由于AC吸附培養基中的某些成分(激素等)或吸附植物體釋放到培養基中的分泌物(酚類物質等)或AC釋放到培養基中的某些雜質影響培養物代謝等[19]。

植物組織培養中根的發生是由根原基或愈傷組織分化形成[6]，不同的分化機理形成不同的根形態，最終影響幼苗移栽馴化的成活率。本研究中，不同處理中，激素種類及其水平差異較大(表1)，致使滇紅食用玫瑰莖段的成株率和植株生根率差異較大(表3)，形成了4種不同的發根方式(表2)，而只有能使植株基部無愈傷組織的培養基才是試驗篩選的目標，因為只有這種根形態才有利于以后幼苗的移栽馴化。植株基部有愈傷組織或根是從愈傷組織發出的(愈傷根)，均不利于幼苗的生長，因為基部的愈傷組織會阻礙水分養分的運輸，且從愈傷組織處產生的根系不與分化芽的疏導系統相通(不與維管束相連)，吸收功能比較弱，成活較難[20]。

本研究不同的試驗處理，因基礎培養基營養成分、激素種類及水平的差異(表1)，致使滇紅食用玫瑰的莖段成株率、植株生根率、株高、生根量、根長、生根方式、生長等表現出了較大差異(表2)，通過試驗，獲得了滇紅食用玫瑰的生根規律，篩選出了最佳生根培養基，其成株率和生根率均大于90 %，根系發育良好，植株生長茂盛(表2)。本研究篩選出的生根培養基可應用于滇紅食用玫瑰工廠化組織培養育苗。

[1]陳 燕,蔣德俊.食用玫瑰高產高效栽培技術[J].現代農業,2003(2):14-15.

[2]李文玲,馬大鵬,王會娟,等.食用玫瑰的栽培技術[J].河南農業科學,2005(4):67-68.

[3]汪祿祥,黎其萬,陳錦玉,等.不同品種食用玫瑰的主要營養成分測定[J].廣東農業科學,2006(12):44-45.

[4]蘇 江.我國食用玫瑰供不應求[J].農村實用科技信息,2008(2):58.

[5]孫曉麗,賈艷芳,高 儀,等.歐李增殖培養基的優化研究[J].中國農學通報,2013,29(31):118-122.

[6]胡尚連,王 丹.植物生物技術[M].成都:西南交通大學出版社,2004.

[7]李浚明.植物組織培養教程[M].北京:北京農業大學出版社,1991.

[8]徐妙珍,張雅君,李 偉,等.林木組織培養的障礙因素及其對策[J].林業科技,1992,17(3):10-12.

[9]張紅曉,經劍穎.木本植物組織培養技術研究進展[J].河南科技大學學報(農學版),2003,23(3):66-69.

[10]徐振華,王學勇,李敬川,等.試管苗瓶外生根的研究進展[J].中國農學通報,2002,18(4):84-86,89.

[11]趙玉芬,徐 強,孟維英.試管苗瓶外生根技術[J].河北林業科技,2004(2):50.

[12]黃卓忠,嚴華兵.試管苗瓶外生根技術[J].廣西農業科學,2007,38(2):124-126.

[13]焦淑華.歐李試管苗瓶外生根研究[J].赤峰學院學報(自然科學版),2008,24(1):31-33.

[14]范志強,付 瑞,陳愛美,等.黃金槐組培苗的瓶外生根試驗[J].山東林業科技,2005(5): 19-20.

[15]程淑云.藍莓組培苗瓶外生根技術的研究[J].農業科技通訊, 2009(4): 48-50.

[16]康 冰,于福科,張廣軍,等.應用正交試驗篩選玫瑰莖段增殖培養基[J].西北植物學報,2003,23(4): 653-655.

[17]于福科.關于玫瑰組培快繁關鍵技術的研究[D].楊凌:西北農林科技大學,2003.

[18]靳 松,陳澤斌,夏體淵,等.食用玫瑰組培快繁關鍵技術研究[J].西南農業學報,2015,28(6):2701-2705.

[19]黃學林,李 菊.高等植物組織離體培養的形態建成及其調控[M].北京:科學出版社,1995.

[20]張存旭,宋 敏,趙 忠.栓皮櫟莖段離體培養的研究[J].西北植物學報,2004,24(7): 1260-1265.

(責任編輯 王家銀)

ScreeningTestofRootingMediuminTissueCultureofDianhongEdibleRose

LI Xiao-liang1, ZHANG Jun-yun1 *, ZHANG Zhong1, DONG Chun-fu2, YANG Shi-xian1, WANG Wen-zhi1, ZHANG Jian-kang1, ZHANG Cui-ping1

(1.Yuxi Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Yuxi 653100, China; 2. Tonghai Jinhai Agricultural Science and Technology Development Company Limited, Yunnan Tonghai 652700, China)

The plant tissue culture technology can be used to solve bottleneck existing in the traditional seedling breeding of edible roses. In this approach, the biggest technological obstacle is greatly difficult for rooting induction which always impedes tissue culture development of most wood plants including edible roses for a long time. For this, L16(45) orthogonal experiment and additional experiments were conducted on Dianhong edible rose to study effects of different factors on tube rooting and to screen out an appropriate rooting medium in tissue culture. The results showed that the great differences occurred in differentiation, growth and rhizogenesis among different treatments. The formation plant rate and the pant rooting rate were mainly controlled by hormones, and plant root formation was in 4 ways. The appropriate tube rooting medium for Dianhong edible rose was 1/2MS+6-BA0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+AC0.1 % or 1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+ AC0.1 %, which had 92.86 % and 93.33 % of formation plants rate, 95.38 % and 96.43 % of pant rooting rate, respectively. Plant root formation in the appropriate tube rooting medium was from the base of a stem segment and the base without callus, which had fine toots, yellow leaves and flourishing plants. Therefore, the results could be applied to industrial tissue culture seedling of Dianhong edible rose.

Edible roses; Tissue culture; Tube rooting; Medium; Orthogonal experiment

1001-4829(2017)3-0656-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.031

S685.12

A

2015-05-11

玉溪市農業科學院科研項目“作物組培擴繁及配套栽培技術研究與應用”(YXNKY201303)

李曉亮(1982-)，男，農藝師，碩士，主要從事農業技術和植物組織培養技術的研究,E-mail：lixiaoliangyn@qq.com，*為通訊作者，E-mail:yuhebio@163.com。