早幼粒白血病在銀屑病病人外周血淋巴細胞中的表達及其與p53和bcl-2家族的相關性

彭世光 李 娜 藍祖連 李 莉 何焱玲

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院皮膚科，北京 100020)

·皮膚病性病診療與研究·

早幼粒白血病在銀屑病病人外周血淋巴細胞中的表達及其與p53和bcl-2家族的相關性

彭世光 李 娜 藍祖連 李 莉 何焱玲*

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院皮膚科，北京 100020)

目的研究早幼粒白血病(promyelocytic leukaemia，PML)、p53、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)和bcl-2相關X蛋白(bcl-2 associated X protein，bax)在銀屑病外周血淋巴細胞中的表達，并評估上述因子之間的相關性。方法分離25例銀屑病病人和20例健康對照的外周血淋巴細胞，通過qRT-PCR和流式細胞學分別檢測PML、p53、bcl-2和bax在外周學淋巴細胞中mRNA和蛋白的表達水平。采用Pearson相關性分析評估PML與上述因子之間的相關性。結果與健康對照相比，銀屑病病人外周血淋巴細胞中PML和p53的mRNA及蛋白表達增加，bcl-2的mRNA及蛋白表達下降，bax的mRNA表達下降但蛋白表達增加。PML蛋白表達與p53、bcl-2以及bax蛋白表達呈相關性。結論PML可能參與了銀屑病發病過程。

早幼粒白血??；銀屑?。籶53；Bcl-2家族；凋亡

銀屑病是一種慢性、自身免疫性、復發性、炎性反應、系統性皮膚病。其特征性病理表現為表皮過度增生及分化異常，真皮及表皮炎性細胞浸潤以及真皮毛細血管擴張[1]。盡管銀屑病的發病機制尚未完全清楚，目前認為T細胞，尤其是T輔助細胞(T help cell, Th)1/Th17在銀屑病發病中具有重要作用[2]。細胞生長與凋亡之間的平衡對于維持機體正常功能尤為重要。如果該平衡失衡，將可能出現細胞增生甚至誘導腫瘤出現。研究[3]提示銀屑病具有并發惡性腫瘤高風險，尤其是血液系統惡性腫瘤。銀屑病角質細胞存在凋亡耐受，部分治療尤其是紫外線光療，其治療效果部分依賴于誘導皮膚淋巴細胞凋亡[4]。但銀屑病外周血中淋巴細胞凋亡特征目前尚不清楚。

早幼粒白血病(promyelocytic leukaemia，PML)基因位于急性早幼粒白血病t(15：17)轉位，PML基因在許多異常增生性疾病中對細胞生長和增生具有負向調節作用[5]。PML蛋白在細胞亞核巨分子中特征性地聚集形成PML-核體(PML-nuclear bodies，PML-NBs)，與多種細胞因子包括p53和B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)家族相互反應，從而調節細胞凋亡[6-7]。

目前對銀屑病細胞凋亡的研究多集中在角質形成細胞領域，而銀屑病外周血淋巴細胞中PML、p53和bcl-2家族的表達情況尚不清楚。在本研究中檢測銀屑病外周血淋巴細胞中PML、p53、bcl-2和bcl-2相關X蛋白(bcl-2 associated X protein，bax)的mRNA和蛋白表達水平，并評估上述蛋白表達間的相關性，以期研究PML在銀屑病發病中可能發揮的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象

25例尋常性銀屑病病人和20例健康對照被納入本研究。其中，尋常性銀屑病病人中男性15例，女性10例；健康對照組男性12例，女性8例。尋常性銀屑病病人和健康對照組平均年齡分別為(43.26±8.34)歲和(42.78±7.96)歲，2組人群性別及年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。所有受試者均簽署知情同意書。排除了高血壓、糖尿病、心功能不全、妊娠及腫瘤病人。每例病人采取4 mL全血用于研究。

1.2淋巴細胞分離及活性檢測

2 mL新鮮全血與2 mL PBS混合后緩慢加入豎立的4 mL淋巴細胞分離液表面。吸取淋巴細胞層，用緩沖平衡鹽溶液洗滌并稀釋淋巴細胞。取100 μL淋巴細胞懸液與等體積0.4%(質量分數)臺盼藍混合，取10 μL混合液滴入血細胞計數儀。死亡淋巴細胞呈藍色，存活的淋巴細胞不染色。計算存活淋巴細胞比例。

1.3qRT-PCR檢測

采用RNAprep Pure Blood Kit試劑盒(天根生化公司，北京)提取淋巴細胞總RNA。采用260/280nm吸光度比值檢測RNA純度。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄cDNA(天根生化公司，北京)。PML、p53、bcl-2和β-actin的引物序列見表1。

PCR反應體系如下：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，61 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共42個循環。所有結果都參照管家基因β-actin來調整mRNA濃度以控制mRNA濃度偏倚。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4流式細胞學熒光檢測

用PE-CD3和FITC-PML雙染全血淋巴細胞。PML、p53、bcl-2和bax抗體購于Santa Cruze 生物技術公司(美國)。流式細胞儀讀取平均熒光強度。

1.5統計學方法

2 結果

2.1淋巴細胞活性和mRNA質量測試

提取的淋巴細胞濃度為(0.5～1.0×10)6/mL，存活淋巴細胞比例>90%。mRNA吸光度A260/A280比值為 2.00±0.15，mRNA純度滿足試驗要求。mRNA瓊脂糖凝膠電泳在28S和18S處有兩條清晰條帶，mRNA完整性滿足實驗要求。

2.2PML在銀屑病病人外周血淋巴細胞中表達增加

銀屑病病人中PML mRNA相對表達量(relative quantity, RQ)值為14.98±3.64，顯著高于健康對照組5.50±1.10(t=16.79,P<0.05)。銀屑病病人組的PML蛋白平均熒光強度為3.13±0.27，高于健康對照組PML蛋白平均熒光強度2.43±0.21(t=6.93,P<0.05)(圖1)。

2.3p53、bcl-2和baxmRNA和蛋白在銀屑病病人外周血淋巴細胞中的表達情況

與健康對照組相比，銀屑病組中p53 mRNA表達增加，銀屑病組和對照組的RQ值分別為1.14±0.42和0.82±0.30(t=2.219，P<0.05)；bcl-2和bax mRNA表達顯著下降，前者在銀屑病組和對照組的RQ值分別為0.54±0.30和0.88±0.20(t=-2.903，P<0.05)；后者在銀屑病組和對照組的RQ值分別為0.42±0.36和0.87±0.30(t=-2.907，P<0.05)(圖2)。

圖1 PML在銀屑病病人外周血淋巴細胞中表達增加Fig.1 Expression of PML increased in peripheral lymphocyte of psoriasis patients

A: RQ value of PML mRNA;B: mean fluorescence intensity of PML protein.*P<0.05vsnormal group.PML:promyelocytic leukaemia;RQ: relative quantity.

圖2 兩組外周血淋巴細胞中p53、bcl-2和bax mRNA表達情況Fig.2 mRNA levels of p53, bcl-2 and bax inperipheral lymphocyte of psoriasis patients andhealthy donors

*P<0.05vsnormal group;RQ:relative quantity;bcl-2: B-cell lymphoma-2;bax:bcl-2 associated X protein.

蛋白表達方面，p53在銀屑病組和對照組的平均熒光強度分別為3.47±0.29和2.90±0.21(t=4.68，P<0.05)和bax在銀屑病組和對照組的平均熒光強度分別為9.38±0.27 和8.32±0.43(t=7.00，P<0.05)。與健康對照組相比，兩者在銀屑病組的表達上調，而bcl-2表達下降，其在銀屑病組和對照組的平均熒光強度分別為3.99±0.29 和4.75±0.31(t=-6.82，P<0.05)(圖3)。

圖3 兩組外周血淋巴細胞中p53、bcl-2和bax 蛋白表達情況Fig.3 Protein levels of p53, bcl-2 and bax in peripheral lymphocyte of psoriasis patients and healthy donors

*P<0.05vsnormal group;bcl-2: B-cell lymphoma-2;bax:bcl-2 associated X protein.

2.4銀屑病病人外周血淋巴細胞中PML蛋白表達水平與p53、bcl-2和bax蛋白表達水平相關

PML-p53、PML-bcl-2以及PML-bax的Pearson相關性系數分別為0.882、0.764和0.741(P<0.05)。銀屑病病人外周血淋巴細胞中PML蛋白表達水平與p53、bcl-2和bax蛋白表達水平具有較強的正相關性。

3 討論

銀屑病中存在凋亡與過度增生平衡失衡。PML可直接或間接地作用于多種凋亡相關因子，從而在上述平衡中發揮重要作用。迄今為止，尚缺乏研究關注PML是否或如何參與調控銀屑病發病過程。本研究結果提示PML蛋白在銀屑病病人外周血淋巴細胞中表達升高，并與p53、bcl-2和bax蛋白的表達呈強相關性。

PML蛋白和PML-NBs已被證實參與多種細胞凋亡調控途徑[6-7]。PML可通過死亡受體途徑如F2、TNF-α、通過調節促凋亡轉錄因子如p53、調節轉化生長因子TGF-β途徑以及內質網相關的凋亡直接調控生長抑制信號。多數研究者[8-9]關注PML在細胞核內的作用，但部分研究[8]顯示PML在胞質內亦可影響生長抑制和細胞凋亡。研究[9]顯示當PML缺失或缺陷，或PML-NBs不能正常組合，細胞將呈現出異常增生，這提示PML在凋亡和異常增生平衡中或發揮內源性保護作用。一項食管鱗狀細胞癌的研究[10]顯示，PML蛋白表達下調與疾病進展及預后不良相關，研究者[10]認為PML可作為食管鱗狀細胞癌的預后生物標志物。就銀屑病而言，PML mRNA在銀屑病皮損中表達上調[11]，但尚無研究關注PML在銀屑病外周血淋巴細胞中的表達。本研究結果顯示PML mRNA和蛋白水平在銀屑病外周血淋巴細胞中表達升高，提示PML或在銀屑病異常的炎性反應狀態中發揮自我平衡作用。

p53在各種疾病的發生、發展過程中均具有重要作用。在銀屑病領域，既往研究多關注于p53在角質形成細胞異常增生中的作用，而非外周血淋巴細胞。Yazici等[11]評估了p53在斑塊型和點滴型銀屑病皮損中的表達情況，發現p53表達升高與慢性斑塊型銀屑病呈強相關。本研究結果提示p53在銀屑病病人外周血淋巴細胞中表達升高且與PML表達相關。研究[12]提示PML參與調控p53介導的信號途徑，PML可通過與p53直接作用調控p53生物學功能，PML募集p53到PML-NBs以促進p53乙?；土姿峄?、結合并抑制p53主要的負性調控因子Mdm2、通過皰疹病毒相關性泛素特異性蛋白酶(herpesvirus-associated ubiquitin specific protease, HAUSP促進p53去泛素化，多種途徑活化p53[13]。研究[14-15]進一步發現，即使突變p53的功能活化亦依賴于PML蛋白。

Bcl-2家族是一類重要的凋亡調控因子，在維持細胞生長和凋亡平衡中具有重要作用。Bcl-2家族同時包括抗凋亡成員(如bcl-2)和促凋亡成員(如bax)。bcl-2和bax同時分布與胞質和核漿內。Bcl-2通過調控編碼凋亡蛋白相關基因并干擾過氧化損傷，從而抑制凋亡。研究[7]顯示bcl-2通過與NF-kappa B形成bcl-2-NF-kappa B復合物抑制NF-kappa B的DNA結合活性，從而阻斷相關基因表達。PML可直接結合bcl-2，從而競爭性抑制bcl-2與NF-kappaB結合，從而促進凋亡。除了PML可與bcl-2結合之外，bax亦可與bcl-2結合形成異二聚體，從而抑制bcl-2的抗凋亡作用。并且bcl-2-bax結合與bcl-2-PML結合呈競爭性方式。在銀屑病領域，研究[16-18]顯示在角質形成細胞中，bcl-2蛋白表達顯著下降；而與對照組相比，銀屑病病人血清bcl-2濃度無顯著變化， 但尚無研究關注bcl-2家族在銀屑病外周血淋巴細胞中的表達情況。本研究結果顯示，與在健康對照中的結果相比，bcl-2 mRNA和蛋白以及bax mRNA在銀屑病病人外周血淋巴細胞中表達下降，而bax蛋白表達升高，且與PML呈相關性。因為蛋白是基因功能的主要執行者，因此更應關注與相關分子蛋白水平的表達。筆者認為bcl-2家族在銀屑病病人外周血淋巴細胞中的表達變化可能是對銀屑病異常炎性反應狀態的一種保護性反應。

總之，與在健康對照組中的表達相比，PML、p53和bax蛋白在銀屑病病人外周血淋巴細胞中表達升高，而bcl-2蛋白表達下降，這將導致淋巴細胞凋亡增加，可能是對銀屑病異常炎性反應狀態的一直保護性反應。本研究結果提示PML蛋白表達與p53、bcl-2和bax蛋白表達相關。PML可能在銀屑病炎性反應中發揮自穩性作用。尚需要進一步的研究明確PML影響哪個亞型淋巴細胞以及其具體的機制。

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Overexpressionofpromyelocyticleukaemiagenecorrelatedwithp53andbcl-2familyinpsoriaticperipherallymphocytes

Peng Shiguang, Li Na, Lan Zulian, Li Li, He Yanling*

(DepartmentofDermatology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of promyelocytic leukaemia (PML) gene, p53, bcl-2 and bcl-2 associated X protein (bax) in psoriatic peripheral lymphocytes, and evaluate the relationships betweenPMLand those candidate proteins.MethodsTwenty-five psoriasis patients and 20 healthy donors were recruited. The peripheral lymphocytes were isolated. The mRNA and protein levels of PML, p53, bcl-2 and bax in peripheral lymphocytes were detected by qRT-PCR and flow cytometry, respectively. Pearson correlation matrix analysis was conducted to evaluate the relationships betweenPMLprotein and those candidate proteins.ResultsThe mRNA and protein ofPMLand p53 were increased, while protein of bcl-2 decreased in peripheral lymphocytes of psoriasis patients as compared to healthy blood donors. The mRNA of bax decreased while protein of bax increased in psoriatic peripheral lymphocytes. The expression of PML protein was correlated with p53, bcl-2 and bax proteins in psoriatic peripheral lymphocytes.ConclusionPML may play a role in the mechanism of psoriasis.

promyelocytic leukaemia (PML)；psoriasis; p53; Bcl-2 family; apoptosis

北京市自然科學基金項目(7102060)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing(7102060).

*Corresponding author， E-mail：heyanling@medmail.com.cn

時間：2017-10-14 16∶19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1619.034.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.003]

R758.63

2017-05-09)

編輯 慕 萌