HIV-1慢性感染者外周血中CD8+干細胞樣記憶型T細胞變化以及對疾病進展的影響

宋冰冰 陸小凡 翁文佳 粟 斌 張 彤 高艷青*

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院皮膚性病科，北京 100069；2.北京市艾滋病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

·皮膚病性病診療與研究·

HIV-1慢性感染者外周血中CD8+干細胞樣記憶型T細胞變化以及對疾病進展的影響

宋冰冰1陸小凡2翁文佳1粟 斌2張 彤2高艷青1*

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院皮膚性病科，北京 100069；2.北京市艾滋病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

目的觀察人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)慢性感染者外周血中CD8+干細胞樣記憶型T細胞(CD8+stem memory T cells， CD8+TSCM)隨治療的動態變化，分析其與疾病進展的關系。方法觀察25例經抗反轉錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)的慢性HIV-1感染者(治療方案為替諾福韋+依非韋倫+拉米夫定)以及36例健康對照者, 對樣本外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)分別用CD3-APCCy7、CD4-FITC、CD8-PerCPCy5、CD45RA-PECy7、 CCR7-APC、CD27-PE、 CD95-Pacific Blue抗體和CD38-PE、HLA DR-APC抗體進行細胞表面染色并通過流式細胞儀檢測CD8+TSCM細胞比例。比較HIV-1慢性感染者和健康者CD8+TSCM細胞比例的差異，并分析其與疾病進展指標(CD4+T細胞計數、HIV病毒載量以及免疫活化指標)的關系。結果HIV-1慢性感染組的CD8+TSCM細胞比例小于健康對照組；CD8+TSCM細胞比例與CD4+T細胞計數呈正相關，與HIV-1病毒載量以及免疫活化指標CD38+HLA-DR+CD8+T細胞呈負相關；隨著ART治療，CD8+TSCM細胞比例在144周后升至健康對照水平。結論CD8+TSCM在慢性HIV-1感染中發揮一定的保護作用，HIV-1相關特異性CD8+TSCM細胞可能是未來T細胞疫苗設計的靶點。

人類免疫缺陷病毒；干細胞樣記憶性T細胞；疾病進展

干細胞樣記憶型T細胞(stem memory T cells, TSCM )是一類具有干細胞特性的記憶性T淋巴細胞。在分化的同時又能夠維持自我更新，占外周血循環T淋巴細胞的2%～4%[1-2]。

TSCM細胞具有很強的抗腫瘤功能[3]。有可能成為最有效的免疫細胞過繼轉移療法(the adoptive cell transfer) 治療腫瘤的細胞類型[4-6]。

TSCM細胞在人/猴獲得性免疫缺陷病毒 (human/simian immunodeficiency virus, HIV/SIV) 感染中的作用也有相關報道[7-9]。首先，TSCM細胞表面表達CCR5和CXCR4，可以被HIV-1感染。同時，研究[10-11]顯示與其他記憶性T細胞亞群相比，TSCM細胞中潛伏的HIV-1具有極高的穩定性。而且，在病毒血癥無進展者(viremic non-progressors, VNP)人群中外周血中TSCM數量高于潛在進展者(putative progressor,PP)，而且VNP病人中央記憶性T細胞(central memory T cells, TCM)和TSCM中HIV-1 DNA含量低于PP組，表明TCM/TSCM亞群被HIV-1感染較少可能與疾病進展緩慢相關[12]。本研究欲通過分析CD8+TSCM 與 CD4+T細胞計數、HIV-1病毒載量、免疫活化指標CD38+HLA-DR+CD8+T淋巴細胞的相關性,總結CD8+TSCM細胞與HIV-1疾病進程的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象

選取首都醫科大學附屬北京佑安醫院隨訪的HIV-1感染者25例, 發現HIV-1抗體確認陽性時間均大于12個月,均經替諾福韋、依非韋倫、拉米夫定抗病毒治療；健康對照36例為首都醫科大學附屬北京佑安醫院門診的健康志愿者, HIV-1抗體確認陰性, 既往3個月未進行任何治療。病人資料詳見表1。所有臨床標本的獲取均通過北京佑安醫院倫理委員會批準, 并有受試者書面同意。

1.2材料

EDTA抗凝管采血10 mL,4 h內用Ficoll(Pharmacia公司,瑞典)方法分離單個核細胞,送實驗室-135 ℃冰箱凍存待用。熒光單克隆抗體 CD3-APCCy7、CD4-FITC、CD8-PerCPCy5、CD45RA-PECy7、CCR7-APC、CD27-PE、CD95-Pacific Blue、CD38-PE、HLA DR-APC抗體均購自美國BD公司；病毒載量檢測試劑盒購自德國羅氏公司。

1.3方法

1.3.1 標本采集及外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的分離

用 10 mL EDTA抗凝負壓真空采血管采集外周靜脈血,采用Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMCs。

1.3.2 CD4+T細胞計數檢測

取新鮮全血50 μL,放入專用的CD4絕對計數管中, 加CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Percp抗體,混勻后,室溫避光孵育15 min,加入450 μL免洗溶血素,充分混勻,室溫避光 15 min 后上機, 采用 MultiSET 軟件自動計數系統檢測CD4+T細胞絕對計數。

1.3.3 病毒載量檢測

病毒載量依據檢測試劑盒說明書進行檢測, 檢測下限為40拷貝/mL。

1.3.4 流式檢測

取凍存的PBMC分別加入不同單色熒光抗體:CD3-APCCy7,CD4-FITC,CD8-PerCPCy5,CD45RA-PECy7,CCR7-APC,CD27-PE,CD95-Pacific Blue，CD38-PE, HLA DR-APC進行細胞表面染色,用FAC SC licar流式細胞儀(美國BD公司)檢測T細胞和CD8+TSCM細胞比例。

1.4統計學方法

2 結果

2.12組人群外周血CD8+TSCM細胞比例的比較

本研究包括25名慢性HIV-1感染者和36名健康對照者。基本資料詳見表1。所有研究對象均為男性。 HIV-1組CD4+T 淋巴細胞的比例明顯低于健康對照組(P<0.000 1)。為確定慢性HIV-1 對CD8+TSCM細胞比例的影響, 筆者對健康對照組和HIV-1慢性感染組外周血中CD8+TSCM比例進行了比較。CD8+TSCM細胞定義為 CD3+CD8+CD45RA+CCR7+CD27+CD95+(圖1A)。HIV-1慢性感染組的CD8+TSCM細胞的比例明顯小于健康對照組 (P<0.000 1，圖1B)。

表1 HIV-1感染者及健康志愿者資料Tab.1 Summary of HIV-1 patients andhealthy control subjects characteristics

***P<0.000 1vshealthy control；HIV-1: human immunodeficiency virus-1;NA: not applicable.

2.2CD8+TSCM細胞比例與疾病進展指標的相關性

HIV-1人群基線水平CD8+TSCM比例與HIV-1

RNA病毒載量呈負相關(r=-0.57，P=0.007，圖2A)，與CD4+T 細胞計數呈正相關 (r=0.42,P=0.04，圖2B)。CD38+HLA-DR+CD8+T 細胞與CD8+TSCM細胞比例呈負相關 (r=-0.45,P=0.04，圖2C)。

2.3隨著ART治療CD8+TSCM細胞比例的動態變化

與設想的一致，隨著抗反轉錄病毒治療(antiretrovial therapy, ART)，CD4+T 細胞的計數逐漸升高 (P<0.000 1, 圖3A)；CD8+TSCM細胞比例在ART 治療12周前呈下降趨勢，隨后上升，在治療48周后又出現下降，隨后逐步上升直至144周升至健康對照水平(P<0.01, 圖3B)；活化指標 CD38+HLA-DR+CD8+T在長期的ART治療后明顯下降(P<0.000 1, 圖3C)。 總體， CD8+TSCM細胞隨ART的動態變化與外周循環中CD4+T計數變化一致，與 CD38+HLA-DR+CD8+T 細胞變化水平大致相反。

圖1 CD8+ TSCM細胞比例的比較Fig.1 Comparison of CD8+ TSCM cells proportion

A:flow cytometry gating strategy for CD8+TSCM cells;B:decreased proportion of CD8+TSCM cells in chronically HIV-1-infected patients;***P<0.000 1vshealthy controls;TSCM:stem memory T cells;HIV-1:human immunodeficiency virus-1;HC:healthy controls;CM:central memory;EM:effector memory;SCM:memory stem cells.

圖2 CD8+TSCM細胞比例與疾病進展指標的相關性Fig.2 CD8+TSCM cell proportion were correlated with disease progression markers

A: correlation between the baseline level of CD8+TSCM cell proportion and plasma viral blad;B:CD4+T cell counts;C: T cell immune activation;TSCM:stem memory T cells;pVL:plasma viral load.

圖3 HIV-1慢性感染組CD8+TSCM細胞隨著ART治療的變化Fig.3 Response of CD8+TSCM cells to ART in chronic HIV-1 infected patients

A: changes in the CD8+T cell count;B: CD8+TSCM cell count;C: level of T cell immune activation;***P<0.000 1;ART：antiretroviral therapy;HIV-1：human immunodeficiency virus-1.

3 討論

筆者研究發現與健康對照組相比，HIV-1感染組外周血中CD8+TSCM細胞比例明顯降低，而且該比例與CD4+T細胞計數呈正相關，與HIV-1病毒載量以及免疫活化指標CD38+HLA-DR+CD8+T細胞呈負相關。這一現象提示高比例的CD8+TSCM亞群，可能降低免疫活化水平，該亞群可能與功能性免疫系統相關。本課題組的結果也表明CD8+TSCM細胞可能利于免疫系統對HIV-1病毒的抑制，同時有助于免疫功能的維護和較低水平的T細胞活化。而且隨著抗反轉錄病毒治療CD8+TSCM細胞比例逐漸接近健康個體，在一定程度上反映了治療對免疫功能恢復的效果。

既往研究[13-14]已經明確CD8+T細胞可以直接殺傷靶細胞抑制病毒復制維持CD4+T細胞數量。本研究中發現CD8+TSCM比例與HIV-1病毒載量呈負相關,與CD4+T細胞計數呈正相關,這也提示該細胞亞群利于疾病的預后。

HIV-1感染與系統性免疫激活有關，這種激活導致免疫衰竭，增加非艾滋病相關疾病的發生，最終發展到艾滋病[15]。而本研究表明CD8+TSCM百分數與免疫活化指標CD38+HLA-DR+CD8+T細胞百分數呈負相關，也提示CD8+TSCM對慢性HIV-1感染起保護作用。但是該細胞亞群對免疫活化影響的機制仍未研究清楚。

綜上所述，本研究表明CD8+TSCM細胞與HIV疾病進程具有相關性，CD8+TSCM在慢性HIV-1感染中發揮一定的保護作用，HIV-1相關特異性CD8+TSCM細胞可能是未來T細胞疫苗設計的靶點。

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DynamicchangesofCD8+stemmemoryTcellsandtheireffectsondiseaseprogressioninchronicHIV-1infection

Song Bingbing1, Lu Xiaofan2, Weng Wenjia1, Su Bin2, Zhang Tong2, Gao Yanqing1*

(1.DepartmentofDermatology,BeijingYouanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofAIDSResearch,Beijing100069,China)

ObjectiveTo study the dynamics of CD8+stem memory T cells (TSCM) and the impact of CD8+TSCM cells on disease progression of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) infection.MethodsTwenty-five cases with chronic HIV-1 infection receiving antiretroviral therapy (ART) with tenofovir plus efavirenz + lamivudine and 36 healthy controls were enrolled and observed. Peripheral blood mononuclear cells were stained with using CD3-APCCy7, CD4-FITC, CD8-PerCPCy5, CD45RA-PECy7, CCR7-APC, CD27-PE, CD95-Pacific Blue, CD38-PE, HLA DR-APC monoclonal antibodies, then CD8+TSCM cell percentage were determined by flow cytometry.To compare the difference of CD8+TSCM cell percentage between HIV-1 chronic infected persons and healthy subjects, and to analyze the relationship between CD8+TSCM cell percentage and disease progression index (CD4+T cell count, HIV-1 viral load and immune activation index).ResultsChronic HIV-1 infection resulted in a decrease of the CD8+TSCM cell proportion in HIV-1 patients. CD8+TSCM cells positively correlated with CD4+T cell counts and negatively correlated with plasma viral load and CD8+T cell activation. Prolonged ART successfully recovered the CD8+TSCM cells, and the dynamic change of CD8+TSCM cells was in parallel with CD4+T cell restoration and a decrease in the level of T cell immune activation.ConclusionIn summary, this report identifies CD8+TSCM as a correlate of protection from disease progression. HIV-1-specific CD8+TSCM can presumably directly contribute to the design of T cell-based vaccines.

human immunodeficiency virus; stem memory T cells; disease progression

北京市科技計劃(D141100000314005)。This study was supported by Science and Technology Plan of Beijing (D141100000314005).

*Corresponding author， E-mail：gyqing2001bj@sina.com

時間：2017-10-14 16∶19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1619.028.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.004]

R512

2017-05-09)

編輯 孫超淵