蜂膠水溶液處理污染種植體的體外實驗研究

楊 宇 周 璿 王陳保 王左敏

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院口腔科,北京 100020)

·基礎研究·

蜂膠水溶液處理污染種植體的體外實驗研究

楊 宇 周 璿 王陳保 王左敏*

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院口腔科,北京 100020)

目的探討蜂膠水溶液對牙周主要致病菌的殺滅作用及對污染種植體表面消毒清潔作用。方法使用液體稀釋法測定不同濃度的蜂膠水溶液，分別處理處于對數生長期的牙齦卟啉單胞菌及成熟菌斑膜。采用菌落計數法和計算平均殺菌率來檢測殺菌效果。將形成牙齦卟啉單胞菌菌膜的鈦片置于各處理組中，采用掃描電鏡觀察各組試件表面黏附細菌的形貌變化。結果肉眼可見隨著蜂膠水溶液濃度的升高，其菌落數量逐漸降低。菌落計數結果表明，不同濃度蜂膠水溶液處理的牙齦卟啉單胞菌菌落數差異有統計學意義。各個濃度的蜂膠水溶液平均殺菌率差異有統計學意義。1.875 g/L的蜂膠水溶液平均殺菌率接近50%，3.75 g/L的平均殺菌率達到了60%以上，7.5 g/L的平均殺菌率達到了90%以上。掃描電鏡觀察顯示, 蜂膠水溶液處理前后的牙齦卟啉單胞菌部分菌體細胞完整性受到了破壞。結論蜂膠水溶液對牙齦卟啉單胞菌具有良好的殺菌作用，可以作為治療種植體周圍炎的一種輔助方法。

蜂膠；生物膜；化學清創；鈦；種植體周圍炎；牙齦卟啉單胞菌

人工種植牙是治療牙缺失的重要方法之一。牙種植體處于復雜的口腔微生態環境中，同天然牙一樣，余留牙的牙周微生物群可作為細菌庫，其內的微生物不斷遷移到種植體周圍。如果已經骨整合的種植體在行使功能過程中，種植體頸部菌斑堆積,致病菌通過其菌體表面物質產生的毒素及代謝產物等破壞種植體周圍軟組織封閉屏障以及骨性結合界面,就會導致種植體周圍炎并最終出現骨性結合界面喪失,導致種植失敗。統計[1]顯示種植體的初期感染率是5%～8%，種植十年后的種植體周圍炎發生率為10.7%～47.2%，因此種植體周圍炎的高患病率和高危害性使種植體周圍炎的有效治療成為醫學界當前重要的課題之一。大量的動物實驗和臨床檢查[2-3]已經證實菌斑生物膜的積聚是種植體周圍炎發生和發展的主要原因。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)目前被認為是人類最重要的牙周病以及種植體周圍炎病原菌[4]，是菌斑生物膜中的致病優勢菌，與種植體周圍炎的發生有密切關系。牙周病和種植體周圍炎防治的關鍵是殺滅牙周和種植體周圍表面的細菌生物膜。因此，研究有效的控制牙齦卟啉單胞菌的方法對于治療慢性牙周炎及種植體周圍炎就至關重要。本實驗采用蜂膠水溶液，觀察其對牙周主要致病菌的殺滅作用，達到清潔污染種植體表面的作用。

1 材料與方法

1.1實驗鈦片的制備

西北有色金屬研究院提供，醫用級純鈦99.9%，切割成規格為10 mm×10 mm×1 mm的試樣。砂紙打磨后，先后在去離子水、無水乙醇、丙酮中超聲清洗各20 min，之后進行高溫高壓滅菌處理，放入烘箱干燥待用。

1.2牙齦卟啉單胞菌的復蘇和培養

牙齦卟啉單胞菌標準菌株(ATCC33277)，由首都醫科大學附屬北京口腔醫院提供保存菌種。復蘇保存在-70 ℃的牙齦卟啉單胞菌，用無菌接種環在厭氧培養基上接種，并在37 ℃厭氧培養箱[85%(體積分數) N2, 10%(體積分數) H2， 5%(體積分數) CO2]內培養5 d。挑取典型的單菌落，接種于培養液中培養2 d, 使用麥氏比濁儀將菌液濃度調制成 0.5 麥氏濃度(1.5×108CFU/mL)備用。

1.3蜂膠水溶液的制備并處理細菌

將100 g/L水溶性北京蜂膠提取物[5](中國農業科學院提供)按1∶2的梯度逐級成倍稀釋,即制備7.5 g/L、3.75 g/L、1.875 g/L三種濃度蜂膠水溶液。將雙蒸水和不同濃度蜂膠水溶液各4.5 mL 加入0.5 mL 菌液，振蕩器混勻。分別取樣100 μL，接種于BHI瓊脂培養基，37 ℃厭氧(85% N2, 10% H2， 5% CO2) 培養5 d后進行菌落計數(用菌落形成單位colony forming units，CFU 表示)。每個實驗組設立3個平行對照，并重復3次實驗，對菌落數取對數后進行分析。

1.4鈦片生物膜的制備

將消毒備用的鈦片在 37 ℃下用人工唾液浸泡 24 h，待其表面形成獲得性膜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)輕輕沖洗鈦片，轉移至無菌24 孔板中，每孔加入菌液(調整為 1.5×108CFU/mL )1 mL,專性厭氧培養 48 h，使鈦片表面生成牙齦卟啉單胞菌單一菌種的生物膜。吸出24 孔板中菌液, 加入約10 mL PBS，震蕩, 洗去浮游和黏附不緊密的細菌，完成3次洗滌后，濾紙輕吸去多余液體，再分別放入蜂膠水溶液和培養液后培養48 h。PBS沖洗震蕩，放入 2.5%(體積分數)戊二醛溶液中固定 24 h，之后依次梯度乙醇脫水，二氧化碳臨界點干燥，噴金后，Zeiss Supra 55 掃描電鏡下觀察牙齦卟啉單胞菌生物膜形成情況。

1.5統計學方法

2 結果

2.1蜂膠水溶液處理牙齦卟啉單胞菌結果

如圖1所示，空白對照組長滿了黑色或棕黑色、直徑約1 mm的單個菌落；隨著蜂膠水溶液的濃度增加，其殺菌效果也越來越強。實驗結果表明，經過7.5 g/L蜂膠水溶液處理后，牙齦卟啉單胞菌已經大部分被殺滅。菌落計數結果表明，不同濃度處理的菌落數(對數值)差異有統計學意義(F=232.804,P<0.001)，在各濃度的比較中，7.5 g/L、3.75 g/L、1.875 g/L三種濃度的存活菌落數均與起始菌落數差異有統計學意義(P<0.01)；7.5 g/L、3.75 g/L的存活菌落數與1.875 g/L蜂膠水溶液處理后的存活菌落數比較差異有統計學意義(P<0.01)；7.5 g/L與3.75 g/L的存活菌落數之間差異有統計學意義(P<0.01)。

不同濃度的蜂膠水溶液平均殺菌率差異有統計學意義(F=389.46,P<0.001)，在各濃度的比較中，7.5 g/L、3.75 g/L蜂膠水溶液的平均殺菌率與1.875 g/L的平均殺菌率差異均有統計學意義(P<0.01)；7.5 g/L與3.75 g/L蜂膠水溶液的平均殺菌率之間差異有統計學意義(P<0.01)。1.875 g/L蜂膠水溶液的平均殺菌率接近50%，3.75 g/L的平均殺菌率達到了60%以上，7.5 g/L的平均殺菌率達到了90%。綜上所述，菌落計數與蜂膠水溶液的濃度具有相關性，詳見表1。

2.2蜂膠水溶液作用鈦片生物膜后細菌形態觀察結果

如圖2所示，經掃描電鏡觀察顯示，雙蒸水組(圖2A)鈦片表面的細菌菌細胞分散且大多為單個生長，牙齦卟啉單胞菌菌細胞形態規則呈球形或球桿形，邊緣光滑為正常菌體形態。1.875 g/L組(圖2B), 菌細胞體積增大，菌體拉長，細菌之間相互集聚呈鏈狀生長。3.75 g/L組(圖2C)菌體形態出現較大變異，呈現不規則狀。部分菌體崩解破碎。在7.5 g/L組(圖2D)中, 掃描電鏡可見細菌胞壁和胞膜破裂, 胞質外溢, 細胞皺縮, 失去原有形態, 僅殘存一些細胞碎片。

ConcentrationofPs/(g·L-1)ChangesinthequalityofPorphyromonasgingivalisafterpropolisssolutiontreatmentMeanrateofkillinggerms/%0 5.82±0.031.8755.54±0.04*46.21±5.003.755.41±0.03*#60.55±3.46#7.54.74±0.19*#Δ91.00±3.71#ΔF232.804389.46P<0.001<0.001

*P<0.01vs0 P’s group，#P<0.01vs1.875 g/L P’s group，ΔP<0.01vs3.75 g/L P’s group;P’s:propolis’s solution.

圖1 蜂膠水溶液的殺菌效果Fig.1 Inactivation of Porphyromonas gingivalis by propolis’s solution with different parameters

A：control group;B:1.875 g/L propolis’s solution;C:3.75 g/L propolis’s solution;D:7.5 g/L propolis’s solution.

圖2 蜂膠水溶液處理鈦片生物膜后掃描電鏡下形態變化Fig.2 Surface morphology of Porphyromonas gingivalis evaluated using SEM after propolis’s solution treatment

A：control group;B:1.875 g/L propolis’s solution;C:3.75 g/L propolis’s solution;D:7.5 g/L propolis’s solution;SEM:scanning electron microscope;Red arrows represent the classical cell’s edge and the damage particle after propolis’s solution treatment.

3 討論

蜂膠是蜜蜂上腭腺分泌液混合花粉和樹脂類產生的一種膠體物質，它含有多種生理活性物質，具有廣泛的生理和藥理作用，更是具有很強的防腐殺菌作用。由于蜂膠含有大量的黃酮類及芳香酸、脂肪酸及烯類等多種化合物，目前在根管消毒、牙周炎和口腔黏膜疾病的治療領域有廣泛的研究和應用[6]。已有研究[7]表明，蜂膠的生物安全性很好，可用于蓋髓治療，能誘導修復性牙本質形成。本課題組于1994年開始，研究蜂膠對主要致齲菌(變形鏈球菌、乳酸桿菌)體外抑菌實驗，結果表明，蜂膠抑菌作用高于黃芪、黃連、銀花、連翹等中草藥[8]。Asawahame等[9]報道蜂膠對變形鏈球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為1.172 mg/mL,最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)為4.688 mg/mL。Elbaz等[10]研究顯示埃及蜂膠和新西蘭蜂膠對變形鏈球菌的MIC分別為100～200 μg/mL和5～50 μg/mL。

在種植體感染中，細菌在種植體表面的黏附定植是其進一步發揮致病性的首要條件。去除種植體表面最初的菌斑膜，將阻止細菌的進一步附著，這樣有利于治療種植體周圍炎[11]。種植體表面形態復雜，單獨使用機械清創方法效果有限，不足以去除種植體表面的生物膜。機械清創方法有可能會影響種植體表面形態特征， 進一步影響成骨性。化學清創可以降低菌斑膜的再生長，優勢是將種植體表面受到的機械損傷降低至最小程度。目前，表面改性是提高其骨結合的有效方法，通過控制周圍感染，提高種植成功率。促進種植體-骨結合并減少感染的方法主要包括：改性種植體表面能量、成分、表面形貌和粗糙度，以及增加功能性表面涂層[12]。通過抗生素加載表面涂層或直接使用抗生素，使種植體具有殺滅黏附細菌的性能是種植體表面改性較常規的選擇[13-14]。所用抗菌劑包括無機抗菌劑、生物化學抗菌劑和天然生物抗菌劑三類。盡管這些涂層材料在抑制細菌生長方面是有效的，但這一系統也存在缺點。例如，無機抗菌劑價格較高、存在抗菌遲效性。以鈣磷酸鹽和以殼聚糖為載體復合抗菌涂層材料，抗菌涂層材料可顯著抑制種植體周圍的細菌生長繁殖[15]。但材料使用后的產物(如晶體和酸性物質)可引起炎性反應(如類感染反應)；同時，大劑量使用抗生素會導致耐藥菌株的產生。

蜂膠具有很好的抗菌活性，對細菌、真菌的生長都有一定的抑制作用。蜂膠對牙齦卟啉單胞菌的生長有較好的抑制作用, 并能夠增強奧硝唑的體外抗菌活性。Alhasnawy[16]的研究結果顯示,蜂膠、丁香、綠茶和紅茶可以有效殺滅牙周病病人牙周袋中分離培養的牙齦卟啉單胞菌，可用于治療和預防牙周疾病。Sanghani等[5]在牙周刮治及根面平整術術后輔助使用蜂膠作為藥物治療1個月后，病人的牙齦指數、出血指數、牙周袋探診深度、臨床附著喪失等指標與對照組相比得到明顯改善，蜂膠可以作為慢性牙周炎的輔助治療方法。然而在蜂膠治療種植體周圍炎方面鮮有研究。本文使用蜂膠水溶液研究其對牙齦卟啉單胞菌浮游狀態生長及對附著在鈦片上的成熟菌斑生物膜的作用。

本研究結果顯示，不同濃度的蜂膠水溶液對牙齦卟啉單胞菌有殺滅作用，1.875 g/L的蜂膠水溶液已經有了明顯效果，殺菌率達到50%。3.75 g/L的平均殺菌率達到了60%以上，7.5 g/L的平均殺菌率達到了90%。李蘋蘋等[17]報道當蜂膠濃度>3.125 g/L時，培養基上清液的終末pH值臨界位于pH 5.5以上，體現了較強的產酸抑制作用。Al-Shaher等[18]報道, 4 g/L蜂膠對牙齦卟啉單胞菌產生抗菌效果而對對牙周膜成纖維細胞的相對生長率(relative growth rate, RGR)在75%以上。本研究中7.5 g/L的蜂膠水溶液對牙齦卟啉單胞菌的平均殺菌率達到了90%以上?？赡芘c牙齦卟啉單胞菌細胞表層含有多糖成分的莢膜結構，可以保護菌體免受或少受殺菌物質的作用有關，這與Moisan等[19]的研究結果一致，藥物滅菌難易程度，可能與其所作用細菌的結構不同有很大的關系。

不同產地的蜂膠在化學組成上有所不同，但抗菌作用基本相同，顯示蜂膠抗菌活性為混合物整體效果。蜂膠可通過阻止細胞分化抑制細菌的生長，還能破壞細胞膜和細胞質的有序狀態，引起部分溶菌和抑制細菌蛋白質的合成。生物膜是細菌最常見的生態環境，與浮游菌相比，菌斑生物膜內的細菌的耐藥性和抵抗免疫防御的能力更強。國內關于伊犁黑蜂蜂膠對口腔主要致齲細菌浮游狀態生長、菌斑生物膜形成過程中的作用進行實驗研究[20]表明，伊犁黑蜂蜂膠能滲透單菌生物膜并殺死膜內細菌，蜂膠對菌斑生物膜和對浮游菌的抑制作用的濃度相差并不十分明顯，甚至在低濃度時即可有效抑制生物膜的形成。本研究用掃描電鏡觀察到, 低溫等離子體水處理前后的牙齦卟啉單胞菌部分菌體細胞完整性受到破壞, 胞質外溢, 此可能與細胞壁、膜的破裂有關。

中藥或天然植物提取物，應用歷史悠久、綠色環保、簡單易得、價格低廉、應用方便。但同時，蜂膠對人體也存在著一些不可忽視的不良反應，最主要的是會導致少數過敏體質人群出現過敏性癥狀，如濕疹、接觸性皮炎、口腔干燥、胃腸不適等反應。根據蜂膠變態反應可分為急性過敏反應和慢性過敏反應。蜂膠急性過敏反應起病快，外用一般在12 h之內，口服一般在1周之內。研究[21]表明能夠通過細菌生物轉化過程除去蜂膠中的致敏成分而不影響其生物活性成分，給蜂膠使用者帶來福音。在初次使用或過敏體質者使用用蜂膠之前可做蜂膠過敏反應試驗從而降低其帶來的危害。

蜂膠水溶液可發揮對病原菌的直接抑制作用而不產生耐藥性，不良反應小，因此將其用于臨床十分經濟且安全有效。本研究結果提示, 蜂膠水溶液針對牙齦卟啉單胞菌具有有效殺菌的作用，其在口腔種植體周圍炎的治療和預防中具有廣泛的應用前景。下一步將進行體外和體內實驗進一步明確蜂膠的殺菌機制。并擴大樣本量，優化使用劑型等，將這種“綠色”抗生素推廣應用。

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Effectofpropolis’ssolutiononcontaminatedtitaniumsurfacesaninvitrostudy

Yang Yu, Zhou Xuan, Wang Chenbao,Wang Zuomin*

(DepartmentofStomatology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

ObjectiveTo systematically evaluate the effect of propolis’s solution in killing periodontal main pathogenic bacteria,and identify the mechanisms of sterilization and decontamination of surfaces of contaminated titanium surfaces.MethodsDecontamination effect of propolis onPorphyromonasgingivaliswas determined by the fluid dilution method,and subsequently inoculated with the bacteria ofPorphyromonasgingivalis. The bacteria in specimens were counted by colony-forming units and sterilization rate. The titanium disc were incubated inPorphyromonasgingivalissuspension.The bacterial morphology of each group were characterized by scanning electron microscopy．ResultsWith the extension of the propolis solution concentration,reduce the number of its colonies were found. Colony count at different concentrations there were significant differences. In the comparison of 7.5 g/L，3.75 g/L，1.875 g/L after the survival of the colony count and the initial colony number have significant difference. For the different propolis solution concentrations, on average, sterilization rate had significant difference.Sterilization rate of nearly 50% on 1.875 g/L propolis’s solution, 3.75 g/L of sterilization rate reached more than 60% on average, an average of 7.5 g/L sterilization rate reached more than 90%.To sum up, the colony count and average sterilization rate were associated with propolis solution concentrations. The integrity ofPorphyromonasgingivalisbacterium was damaged after inoculating with propolis solution.ConclusionThe findings of the study suggested that propolis’s solution has good inhibitory effect onPorphyromonasgingivalisand would be a useful approach for the treatment of peri-implantitis.

propolis; biofilms; chemical agents; titanium；peri-implantitis;Porphyromonasgingivalis

國家自然科學基金(81670989，81500854),北京科技計劃基金(Z151100004015100)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81670989，81500854), Beijing Science and Technology Program Fund(Z151100004015100).

*Corresponding author， E-mail：wzuomin@gmail.com

時間：2017-10-14 16∶06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1606.004.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.015]

R782.12

2017-07-06)

編輯 陳瑞芳