血管緊張素Ⅱ對樹突狀細胞功能的影響

陳 晨 孟 艷

(1.首都醫科大學附屬北京潞河醫院 中美神經科學研究所， 北京 101100; 2.首都醫科大學基礎醫學院病理系， 北京 100069)

·基礎研究·

血管緊張素Ⅱ對樹突狀細胞功能的影響

陳 晨1孟 艷2*

(1.首都醫科大學附屬北京潞河醫院 中美神經科學研究所， 北京 101100; 2.首都醫科大學基礎醫學院病理系， 北京 100069)

目的以腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)為對照，探討血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)對樹突狀細胞(dendritic cells, DC)的功能影響并比較DC對上述刺激的反應差異。方法體外培養DC2.4細胞，分別加入20 ng/mL TNF-α和100 nmol Ang Ⅱ誘導DC細胞成熟。用MTT、流式細胞儀、Transwell、混合淋巴細胞反應、FITC-Dxtra內吞實驗、酶聯免疫吸附試驗等方法檢測上述細胞的增生、分化成熟、遷徙、刺激淋巴細胞增生、內吞和分泌細胞因子白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等方面能力。結果與TNF-α相比，AngⅡ可以同等程度抑制DC的增生；可以誘導DC成熟標志表達，其能力弱于TNF-α；可以促進DC的遷徙，能力略弱于TNF-α；可以抑制樹突狀細胞的吞噬能力，其能力弱于TNF-α；促進相關細胞因子IL-6、IFN-γ分泌，與TNF-α作用基本一致；刺激淋巴細胞增生能力增強，其能力弱于TNF-α。結論Ang Ⅱ具有和TNF-α相近的能力，對于樹突狀細胞的功能起著正向調節的作用。

血管緊張素Ⅱ；腫瘤壞死因子-α；樹突狀細胞；免疫

樹突狀細胞 (dentritic cells, DCs) 是分布于外周組織及循環中功能最強大的抗原遞呈細胞[1]。正常情況下，體內大部分DC處于未成熟狀態，可被多種病原微生物、細胞因子和內源性配體等激活轉變為成熟DC。活化的成熟DC高表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex Ⅱ, MHCⅡ)和協同刺激分子CD40及CD80，可以促進T細胞的增生、分化并開啟適應性免疫應答反應。因此，DC的成熟和活化是激活T細胞的必要條件[2-3]。

目前已知的能夠刺激DC成熟的分子，包括傳統的細菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α,TNF-α)等[4]。內毒素是存在于革蘭陰性細胞胞壁外膜的一種活性成分，其主要的毒性成分是LPS。LPS可以作用于抗原提呈細胞，諸如DC細胞、淋巴細胞等，進而促進此類細胞的分化和成熟。TNF-α是一類具有多種生物活性的細胞因子，在抗腫瘤免疫中發揮重要的作用，可以刺激DC的成熟，從而促進DC細胞參與腫瘤免疫應答。此外，還有諸多新的刺激分子被發現，例如白細胞介素-15(interleukin,IL-15)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)等。其中，Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)中最活躍的肽，是維持和升高血壓的關鍵因子。它不僅是一種血管活性物質，引起血流動力學改變，導致高血壓的發生；更為重要的是，它還作為一類炎性反應因子，在炎性反應、自身免疫及衰老過程中起重要作用；此外，研究[5-6]表明Ang Ⅱ在DC細胞的成熟和活化過程中起著重要的作用。

盡管有眾多研究探討Ang Ⅱ在DC細胞分化成熟過程中的作用，但與經典細胞因子TNF-α相比，Ang Ⅱ對DC功能作用的對比研究尚未見報道。本文旨在探討Ang Ⅱ對DC的增生、分化成熟、遷徙、刺激淋巴細胞增生、吞噬和分泌細胞因子等方面的作用，并對比研究其與TNF-α作用的差異。

1 材料與方法

1.1材料

樹突狀細胞系DC2.4由軍事醫學科學院基礎醫學研究所提供；熒光標記的抗MHCⅡ、抗CD40和抗CD80抗體購自美國eBioscience公司；RPMI-1640、胎牛血清和PBS購于美國HyClone公司；Ang Ⅱ、TNF-α購于美國Sigma-Aldrich公司；MTT檢測試劑盒購美國Roche公司；Transwell 購于美國Corning公司；Dextran-FITC購于美國Naoncso公司；IL-6和IFN-γ細胞因子ELISA試劑盒購于北京達科為生物技術有限公司；熒光染料CFSE購于日本Dojindo實驗室；其他試劑均購于美國Sigma-Aldrich和BD公司。酶聯儀購于美國Molecular Devices公司，FAC SCalibur流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2樹突狀細胞培養

樹突狀細胞誘導分化的培養基配方為含10%(體積分數)胎牛血清、20 ng/mL 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、100 μg/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基。DC2.4細胞系使用該培養基進行可傳代細胞常規培養，隔天換液，細胞融合度達80%～90%時進行細胞傳代。

1.3MTT檢測

收集DC2.4細胞，調整細胞數為2.5×105個/mL，將細胞接種于96孔板，每孔 150 μL。分別加入 100 nmol AngⅡ和20 ng/mL TNF-α，繼續培養8、24和48 h后，每孔加入MTT 150 μL，37 ℃ 5% (體積分數)CO2繼續培養6 h，小心棄凈MTT液，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min 混勻，自動酶聯儀490 nm 波長測吸光度值，每孔吸光度值減去空白孔吸光度值為測試孔吸光度絕對值。MTT檢測DC2.4細胞在不同處理下細胞的增生情況。以上各組實驗均設立6個平行孔，重復3次，比較各組間細胞的增生差異有無統計學意義。

1.4DC表面標志物的流式分析

收集DC2.4細胞，以2×105密度重懸于PBS中。利用直接免疫熒光標記法，室溫避光標記FITC-MHCⅡ、FITC-CD40和FITC-CD80 30 min。通過流式細胞儀檢測DC細胞成熟表型，并通過Cell Quest軟件分析。每個樣品均設立熒光標記的同型IgG作為相應的陰性對照。流式分析DC2.4細胞的MHCⅡ、CD40及CD80的表達百分率，以評價樹突細胞的成熟情況。以上各組均設立3個平行孔，重復3次，比較各組間細胞成熟差異有無統計學意義。

1.5DC遷徙能力檢測

收集DC2.4細胞，制備1×105密度細胞懸液。小室外加入400 μL培養基，在小室內加入100 μL的細胞懸液，每組重復4個樣板。培養24 h后，取出Transwell小室進行Gimsa染色，分別挑10個視野進行計數。Transwell小室檢測DC2.4細胞通過小室的細胞數，以評價樹突細胞的遷徙率。以上各組均設立3個平行孔，重復3次，比較各組間細胞遷徙能力差異有無統計學意義。

1.6DC吞噬能力檢測

利用Dextran-FITC攝取量的多少來反映DC的攝取抗原能力。將處理后的DC2.4用含10%(體積分數)胎牛血清的RPMI1640培養基調整細胞濃度為4×108個/L，分別取2×105加入Dextran-FITC (0.5 mg/mL )，混勻后分置4 ℃和37 ℃，2 h后取出，用冰冷的PBS洗滌細胞2次后，再懸于CellFix[1%(質量分數)多聚甲醛]中在流式細胞儀上進行定量分析，以平均熒光密度表示攝取量。每組均設4 ℃對照并減去其熒光密度來排除非主動性攝取。通過流式細胞術檢測DC2.4細胞攝取Dextran-FITC，以評價樹突細胞的吞噬能力。以上各組均設立3個平行孔，重復3次，比較各組間細胞吞噬能力差異有無統計學意義。

1.7ELISA法檢測DC的細胞因子分泌

采用雙抗體夾心法檢測IL-6、IFN-γ等因子，按照說明進行操作，顯色后利用酶標儀檢測450波長的吸光度值A值，根據標準曲線確定IL-6和IFN-γ。以ELISA法檢測DC2.4細胞分泌細胞因子，以評價上述樹突細胞分泌細胞因子的能力。以上各組均設立3個平行孔，重復3次，比較各組間細胞分泌細胞因子能力差異有無統計學意義。

1.8混合淋巴細胞反應

收集培養DC2.4加入絲裂霉素C(50 μg/mL)混合，37 ℃避光水浴30 min后，PBS離心洗滌3次，重懸細胞。同時收集脾臟分離的異種淋巴細胞，以PBS洗滌2次后加入CFSE 2.5 mol/L染液。置于 37 ℃水浴15 min，每5 min搖動1次。用RPMI1640完全培養基終止染色，離心后重懸細胞。將上述細胞和應答細胞按1∶10混合，以200 μL/孔種至96孔U形底細胞培養板，并設立對照。混合培養96 h后，收集細胞并洗滌后進行流式分析。以淋巴細胞的增生比例，評價DC2.4細胞對淋巴細胞增生的影響。以上各組均設立3個平行孔，重復3次，比較各組間促進淋巴細胞反應能力差異有無統計學意義。

1.9統計學方法

2 結果

2.1AngⅡ抑制DC2.4的增生

體外培養DC2.4細胞，經過Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，分別于0、12、24和48 h通過MTT檢測上述細胞的增生情況。結果顯示，Ang Ⅱ和TNF-α在刺激24 h后，相對于正常對照組促進細胞增生的能力(4±0.05)倍，TNF-α為(2±0.03)倍，Ang Ⅱ為(2.5±0.02)倍。兩者均可以明顯抑制樹突細胞的增生，TNF-α略強于Ang Ⅱ；48 h后Ang Ⅱ 和對照組間差異不明顯，TNF-α可以持續抑制樹突細胞的增生。結果顯示，與TNF-α相比，Ang Ⅱ 可以抑制DC2.4的增生，抑制程度與上述刺激相近，但是持久性弱于TNF-α(圖1)。

圖1 Ang Ⅱ及TNF-α抑制DC2.4的增生Fig.1 AngⅡ and TNF-α inhibit proliferation of DC2.4

DCs were treated with TNF-α (20 ng/mL) and Ang Ⅱ (100 nmol) after overnight starvation. MTT analysis of cell proliferation was shown；*P<0.05,**P<0.01vscontrol；TNF-α： tumor necrosis factor-α；AngⅡ：angiotensin Ⅱ；DC：dendritic cells.

2.2AngⅡ促進DC細胞的成熟

體外培養DC2.4細胞，經過Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，分別于刺激后0、12、24、48 h后收取細胞。通過流式細胞儀，檢測細胞表面標志MHC Ⅱ類分子以及共刺激分子(CD40，CD80)的表達以評價樹突狀細胞的成熟程度。結果顯示，DC2.4細胞在Ang Ⅱ及TNF-α刺激后12 h上述分子的表達開始上調，其中MHCⅡ在受到Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，分別于12和24 h達到高峰，分別于24和48 h下降，上調倍數分別為1.7和1.8倍(圖2A)；CD40的表達趨勢基本與MHCⅡ一致(圖2B)；CD80在受到Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，均于24 h達到高峰，48 h下降，上調倍數分別為1.8和2.4倍(圖2C)。綜上，Ang Ⅱ及TNF-α對MHC Ⅱ類分子以及共刺激分子CD40、CD80的作用趨勢基本一致。

圖2 Ang Ⅱ及TNF-α促進DC2.4細胞的成熟Fig.2 AngⅡ and TNF-α promote the phenotypic maturation of DC2.4

DC 2.4 were treated with TNF-α (20 ng/mL) and Ang Ⅱ (100 nmol) for 48 h. The expressions of surface markers on DCs were analyzed with flow cytometry. Indicated numbers were the percentages of positive cells. Histograms showed the expression of MHCⅡ (A), CD40 (B) and CD80 (C)；*P<0.05,**P<0.01vscontrol；DC：dendritic cells；TNF-α： tumor necrosis factor-α；AngⅡ：angiotensin Ⅱ；MHC：major histocompatibility complex.

2.3AngⅡ促進DC細胞的遷徙

體外培養DC2.4細胞，經過Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，通過Transwell實驗，觀察樹突細胞的遷徙能力。結果顯示，Ang Ⅱ可以促進DC細胞的遷徙，其促進細胞遷徙的能力弱于TNF-α，Ang Ⅱ及TNF-α分別為對照組的2倍和2.2倍(圖3)。綜上，Ang Ⅱ及TNF-α對DC細胞遷移的作用趨勢基本一致，均可以促進樹突狀細胞的遷徙。

圖3 Ang Ⅱ及TNF-α促進DC2.4細胞的遷徙Fig.3 Ang Ⅱ and TNF-α increase migration of DC 2.4

DC 2.4 were treated with TNF-α (20 ng/mL) and Ang Ⅱ (100 nmol) for 48 h. Cell migration was measured by Transwell test. Quantitative analysis of cell migration was shown;*P<0.05vscontrol;TNF-α： tumor necrosis factor-α；AngⅡ：angiotensin Ⅱ；DC：dendritic cells.

2.4AngⅡ抑制DC細胞的吞噬能力

吞噬能力的降低是DC成熟的又一標志，以4 ℃下DC對標記FITC的葡聚糖的吞噬能力作為對照，37 ℃下的吞噬能力作為實驗組，經Ang Ⅱ及 TNF-α刺激后，結果顯示DC的胞吞作用均可以被抑制。其中TNF-α下降60%，而Ang Ⅱ刺激后則下降50%(圖4)。綜上，Ang Ⅱ及TNF-α對DC吞噬能力的作用趨勢基本一致，可以抑制樹突細胞的吞噬能力。

圖4 Ang Ⅱ及TNF-α抑制DC2.4細胞的吞噬能力Fig.4 Ang Ⅱ and TNF-α inhibit phagocytosis of DC 2.4

DC 2.4 were treated with TNF-α (20 ng/mL) and Ang Ⅱ (100 nmol) for 48 h. Phagocytosis label by FITC-Dextran was detected by flow cytometry;*P<0.05vscontrol;TNF-α： tumor necrosis factor-α；AngⅡ：angiotensin Ⅱ；DC：dendritic cells.

2.5AngⅡ激活DC分泌細胞因子

經過Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，收集上述細胞的上清，采用雙抗體夾心法檢測IL-6和IFN-γ的表達。結果顯示，經Ang Ⅱ及TNF-α刺激后，結果顯示DC分泌IL-6上調，分別為50 pg/mL和48 pg/mL(圖5A)；而DC分泌IFN-γ上調，分別為205 pg/mL和208 pg/mL(圖5B)。綜上，Ang Ⅱ和TNF-α可以激活DC分泌細胞因子IL-6和IFN-γ，同時組間差異無統計學意義。

2.6AngⅡ促進DC對淋巴細胞激活的影響

樹突細胞與脾臟淋巴細胞共培養進行混合淋巴反應，通過流式細胞術檢測CSFE的表達情況，明確淋巴細胞在刺激后的增生情況。結果顯示，經Ang Ⅱ及TNF-α刺激后DC能夠促進對T細胞的增生，然而兩者活化細胞能力有差異，其中，對照組細胞的活化能力為2.1%，TNF-α最高為16.6%，Ang Ⅱ為8.5%。TNF-α促進DC對淋巴細胞激活的能力是Ang Ⅱ的2倍(圖6)。

圖5 Ang Ⅱ及TNF-α激活DC2.4分泌細胞因子Fig.5 Ang Ⅱ and TNF-α increase the secretion of inflammatory cytokines in DC 2.4

A：IL-6 concentration;B:IFN-γ concentration; DC 2.4 were treated with TNF-α (20 ng/mL) and Ang Ⅱ (100 nmol) for 48 h. The cytokine concentrations of IL-6 and IFN-γ in supernatants from DC culture medium were analysed with ELISA；*P<0.05vscontrol；IFN-γ：interferon-γ；DC：dendritic cells；TNF-α： tumor necrosis factor-α；AngⅡ：angiotensin Ⅱ；IL-6：interleukin-6.

圖6 Ang Ⅱ及TNF-α促進DC 2.4細胞對淋巴細胞激活的影響Fig.6 Ang Ⅱ and TNF-α promote the immunostimulatory capacity of DC 2.4

DC 2.4 were treated with TNF-α (20 ng/mL) and Ang Ⅱ (100 nmol) for 48 h., and then use MIR was used to evaluate the ability to activate T cells;*P<0.05vscontrol;TNF-α： tumor necrosis factor-α；AngⅡ：angiotensin Ⅱ;DC：dendritic cells;MIR:mixed lymphocyte reaction.

綜上，TNF-α促進DC對淋巴細胞激活的能力強于Ang Ⅱ。

3 討論

DC是分布于外周組織及循環中功能最強大的抗原遞呈細胞，體內大部分DC處于未成熟狀態，可被多種病原微生物、細胞因子和內源性配體等激活轉變為成熟DC[7-8]。活化的成熟DC可以促進T細胞的增生、分化、開啟適應性免疫應答反應，越來越受到大家的關注。對于DC的研究在臨床免疫、高血壓治療方面提供了新的思路。

Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素系統中的重要效應分子，在維持血流動力學和動脈粥樣硬化、高血壓和心臟重塑過程中起著重要的作用。Ang Ⅱ在炎性反應方面的作用日益被人們認識，研究顯示Ang Ⅱ可以通過Ang Ⅱ的I型受體參與DC細胞的分化調節[9-14]。筆者在前期研究中發現Ang Ⅱ通過泛素鏈接酶E1在誘導DC成熟的過程中起著重要的作用；應用PYR41(E1抑制劑)抑制E1功能，抑制DC細胞的功能，從而作為一種潛在的免疫抑制劑，為臨床上治療樹突狀細胞介導的自身免疫性疾病和相關心血管疾病提供了新穎的診療思路[15]。

本項研究以TNF-α為對照，探討Ang Ⅱ對DC的影響。研究顯示，與TNF-α相比，Ang Ⅱ可以同等程度抑制DC2.4的增生；在誘導DC成熟標志(MHCⅡ、CD40和CD80)表達方面，上述刺激的基本趨勢相似；在促進DC遷徙方面，Ang Ⅱ的能力弱于TNF-α；在抑制巨噬細胞的吞噬能力方面，Ang Ⅱ的作用弱于TNF-α；在促進相關細胞因子IL-6和IFN-γ的分泌方面，Ang Ⅱ與TNF-α的作用基本一致；在刺激淋巴細胞增生能力方面，Ang Ⅱ的能力弱于TNF-α。綜上所述，Ang Ⅱ具有和TNF-α相近的能力，對DC的增生、成熟、遷徙和內吞、誘導淋巴細胞功能方面均起著正性調節作用。

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AngⅡactivatesdendriticcelltoproduceimmunefunction

Chen Chen1， Meng Yan2*

(1.China-AmericaInstituteofNeuroscience,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China;2.DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the immune effect of angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) on immature dendritic cells (DC) compared with tumor necrosis factor-α (TNF-α)invitro.MethodsPrepared DC2.4 stimulated with different stimuli, such as 20 ng/mL TNF-α and 100 nmol Ang Ⅱ for indicated time. The effects of TNF-α and Ang Ⅱ on the proliferation, maturation, phagocytosis, cytokine secretion, migration, and communication with T cells of DCs are test by MTT, flow cytometry, ELISA, transwell assay and mixed lymphocyte culture respectively.ResultsFirst, the data showed that Ang Ⅱ stimulation significantly inhibited proliferation of DC, induced phenotypic maturation of DC, markedly increased the migration of DC, inhibited macrophage phagocytosis, promoted the secretion of interleukin-6 (IL-6) and interferon-γ(IFN-γ) and initiated the proliferation and activation of T-cell.ConclusionCompared with TNF-α, Ang Ⅱ positively modulated the function of DC to the same extent.

angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ); tumor necrosis factor-α; dendritic cell; immunity

*Corresponding author， E-mail：littlemengyan@163.com

時間：2017-10-14 16∶06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1606.024.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.016]

R392

2017-07-07)

編輯 孫超淵