冷凍電鏡技術：從原子尺度看生命——2017年諾貝爾化學獎簡介

楊 慧 李慎濤 薛 冰

(首都醫科大學中心實驗室，北京 100069)

·諾貝爾獎·

冷凍電鏡技術：從原子尺度看生命——2017年諾貝爾化學獎簡介

楊 慧 李慎濤 薛 冰*

(首都醫科大學中心實驗室，北京 100069)

瑞典皇家科學院將2017年度諾貝爾化學獎授予雅克·迪波什(Jacques Dubochet)、約阿希姆·弗蘭克(Joachim Frank)和理查德·亨德森(Richard Henderson)，以表彰他們在“開發冷凍電鏡技術解析溶液中生物大分子高分辨率結構方面”的貢獻。

諾貝爾化學獎；冷凍電鏡；生物大分子高分辨率結構

北京時間2017年10月4日，瑞典皇家科學院將2017年度諾貝爾化學獎授予瑞士的雅克·迪波什(Jacques Dubochet)、美國的約阿希姆·弗蘭克(Joachim Frank)和德國的科學家理查德·亨德森(Richard Henderson)，以表彰他們在“開發冷凍電鏡技術解析溶液中生物大分子高分辨率結構方面”的貢獻。他們建立了一種高效的方法，可將運動中的分子快速冷凍并借助冷凍電鏡圖像和計算機數據處理繪出其原子水平分辨率的三維結構。這一技術將生物化學的發展推進了全新的時代，三位科學家獲得這一獎項可謂實至名歸。

1933年，德國物理學家Ernst Ruska用電子束作光源、電磁線圈作透鏡，設計并制造出第一臺電子顯微鏡，放大倍數達到12 000倍。1954年西門子公司研制出有電子衍射功能的高分辨電鏡Elmiskop I，被全球1 200家研究單位用于研究工作。此后的30年，電鏡技術得到飛速發展，分辨率已達到單個原子的水平[1]。1986年，Ruska因發明電鏡獲得諾貝爾物理獎[2]。

電鏡技術最初被認為只適用于無機物質的研究[3]，在生物領域的應用受到了諸多不利因素的制約：第一，生物樣品含有豐富的水分，而透射電鏡工作的條件是高度真空環境；第二，高能電子束會對樣品造成破壞；第三，生物樣品主要組分是碳、氫、氧、氮等輕元素，對電子的反射和散射作用與背景相比效果相似，所獲圖像襯度低；第四，觀察過程中蛋白分子與電子發生相互作用或由于溫度變化而發生漂移，導致圖像模糊。直至冷凍電鏡技術的出現和發展才在一定程度上解決了上述問題，結構生物學因此而得到突飛猛進的發展[4]。

冷凍電子顯微鏡，簡稱冷凍電鏡(cryo-electron microscopy，cryo-EM)，是將生物大分子快速冷凍后，在低溫環境下利用透射電子顯微鏡對樣品進行成像，再經圖像處理和重構計算獲得樣品的三維結構[5-6]。經過30年的發展，冷凍電鏡技術已經成為重要的結構生物學研究方法，與X線晶體學(X-ray crystallography)和磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)一起構成了高分辨率結構生物學研究的基礎。不過另外兩種技術都有各自的局限性，比如X線晶體學只能對生長極為有序的三維結晶進行觀察，而磁共振技術則要求被檢測樣品顆粒小，純度非常高，不能夠有重疊峰出現。但是，分子蛋白的特點是難于結晶，很多生物大分子相互結合、組裝之后形成較大復合體，或者不穩定，難以用上述這兩種技術進行分析和檢測。單顆粒冷凍電鏡技術的優勢則是能夠觀察少量非結晶生物樣品，獲得高分辨率的結構圖像，因此，冷凍電鏡技術已成為生物大分子的結構研究的重要手段，這項技術極大地推動了生物學的發展[5-6]。

1 獲獎者簡介

1.1雅克·迪波什(JacquesDubochet)

Jacques Dubochet(圖1)，1942年生于瑞士，1973年博士畢業于日內瓦大學和瑞士巴塞爾大學，現為瑞士洛桑大學生物物理學榮譽教授。20世紀80年代，Jacques Dubochet就職于海德堡歐洲分子生物學實驗室，帶領一個課題組發現了水的玻璃態，成功地建立了單顆粒樣品快速冷凍制樣方法以及可以應用于細胞和組織等體積較大樣品制備的高壓冷凍方法，冷凍電鏡樣品制備問題的解決為冷凍電鏡技術的發展提供了先決條件。時至今日，冷凍電鏡領域的研究者仍然應用該方法來制備樣品。

圖1 雅克·迪波什(Jacques Dubochet)

1.2約阿基姆·弗蘭克(JoachimFrank)

Joachim Frank(圖2)，1940年出生于德國，現在哥倫比亞大學任教，生物物理學家，美國科學院院士和美國人文與科學院院士。2014年獲得本杰明·富蘭克林生命科學獎(Benjamin Franklin Medal in Life Science of the Franklin Institute),2017年獲威利生物醫學科學獎(Wiley Prize in Biomedical Sciences)。Frank 長期以來從事電子顯微鏡成像方面的研究，并在發明冷凍電鏡的過程中做出了重要貢獻。1978年，Frank開始研究冷凍電鏡單顆粒三維重構方法學，1995年，他用自己建立的方法成功解析出大腸桿菌核糖體的三維結構。現今大部分生物大分子冷凍電鏡結構都應用單顆粒三維重構技術解析出來。

圖2 約阿基姆·弗蘭克(Joachim Frank)

1.3理查德·亨德森(RichardHenderson)

Richard Henderson(圖3)，生于1945年，蘇格蘭分子生物學家和生物物理學家，就職于劍橋大學英國醫學研究會分子生物學實驗室(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)。2016年獲得英國最高科學獎皇家科普利獎章)( Copley Medal of the Royal Society)和美國國家研究院頒發的亞歷山大·霍蘭德生物物理學獎(Alexander Hollaender Award in Biophysics)。他是利用電子顯微鏡研究生物分子領域的開創者之一。1990年，Henderson發表了利用冷凍電鏡技術獲得了細菌視紫紅質蛋白原子水平的三維結構模型，這是第一個用冷凍電鏡解析出來的膜蛋白結構。他的研究證實了用冷凍電鏡技術可以確定分子蛋白的近原子分辨率的三維結構，被視作冷凍電鏡發展史上的里程碑。

圖3 理查德·亨德森(Richard Henderson)

2 主要科學貢獻

冷凍電鏡技術發展經過了數十年的歷程，科學家們從提出設想到實踐探索，終于將這一技術發展至相對成熟，現已成為結構生物學研究的利器，用于解析大分子蛋白和蛋白復合體的結構，揭示蛋白生物學功能的分子基礎。總的來說，冷凍電鏡技術由低溫制樣、低劑量電鏡成像和計算機圖像處理三部分組成。

1)冷凍樣品制備

生物樣品的特點是不耐高能電子輻射，并含有大量水分。電子束對樣品的破壞作用迫使科學家們尋找新的樣品制備方法。早在1934年Marton就提出了冷卻樣品的方法[3]。20世紀50年代，Humberto Fernández-Morán開始嘗試用冷卻樣品的方法以減少水分的蒸發和保護樣品免受輻照損傷。他制備了薄層冷凍切片，發現當生物樣品被冷凍后，水分會產生冰晶，冰晶產生強烈的電子衍射，掩蓋了生物樣品本身的信號，而且冰晶可改變樣品的結構。因此，在電鏡觀察之前必須想方設法去除樣品中的水分。然而，經過脫水處理的大分子蛋白結構發生改變，或聚集，或塌陷。顯然，最理想的狀態是在能保留水分的情況下觀察生物樣品[7]。1974年，Kenneth A. Taylor 和Robert M. Glaeser在約-120 ℃(該溫度高于水的玻璃態向冰晶轉化的溫度)的低溫下，觀察到含水生物樣品的衍射圖像，但沒有觀察到冰晶的形成，并將此原因歸結于水分子和蛋白表面相互作用所致。同時，他們發現冷凍樣品不但可以耐受更長時間和更大劑量的電子輻照，并且襯度也有一定程度的提高[8-9]。在此基礎上，Dubochet研究組繼續嘗試利用冷凍電鏡觀察含水生物樣品，他們將液氮換成液態乙烷，發現了水的玻璃態。玻璃態的水和冰不一樣，它無固定的形狀，不存在晶體結構，與固態相比，它更像一種極端黏滯、呈現固態的液體。當Dubochet把這一發現撰寫成論文向期刊投稿時，發現Mayer 和Bruggeler已搶先一步使用X線證實在快速冷凍情況下小水滴可以呈現玻璃態。Dubochet的論文被認為存在“扭曲自然”的爭議而被拒稿。1981年，JournalofMicroscopy同意為他們刊登一篇簡短的通訊。而在此之后，這一技術的發展出乎意料地順利，順理成章地成為冷凍電鏡的制樣方法[10]。其基本流程是把載有樣品(如緩沖液中的病毒、蛋白質和DNA組裝的顆粒等)的電鏡載網快速投入經液氮/液氦冷卻的液態乙烷中，在載網孔或支持膜上形成玻璃態的薄冰，樣品顆粒(粒徑大約十幾到過百納米)分散包埋在其中而形成冷凍樣品(圖4)。薄層水玻璃化法簡單快速，適用于單顆粒生物樣品的研究，此制樣技術被廣泛用于病毒、大分子及其復合體的研究[11]。

圖4 冷凍電鏡樣品制備示意圖[12]

值得一提的是，對于厚度大于1μm的樣品，例如細胞和組織，不能被電子束穿過，不適合用該方法制備樣品。Dubochet研究組意識到唯一能夠克服薄層水玻璃化技術缺陷的方法是先對較大樣品進行玻璃化處理，然后制備超薄切片，這就是CEMOVIS(Cryo-EM of Vitreous Sections)技術。經過25年的努力，Dubochet研究組建立了高壓冷凍技術(high pressure freezing，HPF)，他們發現，在常壓下對生物樣品進行快速冷凍，玻璃化深度只有10μm，而當壓力達到2 kPa時，玻璃化深度則可達到常壓下的10倍[13-14]。目前，應用高壓冷凍技術制備的樣品玻璃化深度可以達到200μm。對玻璃化生物樣品可以進一步制備超薄切片，在冷凍電鏡下可觀察到接近活體狀態的超微結構。以往，傳統生物組織樣品超薄切片制備技術采用固定、脫水、包埋等一系列化學處理，并使用重金屬染色幫助提高圖像的襯度，這些化學處理會破壞觀察對象，在電鏡下形成假象。高壓冷凍制樣技術避免了樣品中可溶性成分的抽取、流失和移位，使研究者可以直接觀察到接近生活狀態的細胞和組織的天然形態[14]。另外，應用冷凍電子斷層成像技術(cryo-electron tomography)可以對高壓冷凍樣品的蛋白分子甚至細胞器進行原位分析和三維重構，對了解蛋白的天然構象和功能具有重要意義[15-16]。

2012年，Dubochet在“冷凍電鏡——第一個三十”評述中所說：“只要處理得當，水就可以成為電鏡的好朋友”。Dubochet的研究改變了長期以來人們對水的狀態的傳統認識，玻璃態水的發現為冷凍電鏡解決了樣品制備的問題[10]。

2)低劑量電子成像技術(low-dose techniques)

有史以來，圖像一直都是人類探索未知事物的關鍵。在冷凍電鏡技術誕生之前，科學家們利用X線衍射和磁共振解析了上千種生物分子的結構，并將這些成果應用于基礎研究和藥物的開發。Henderson最初的專業是晶體衍射技術，他深知X線衍射和磁共振技術的弊端，使他果斷放棄了X線衍射技術，轉向冷凍電鏡技術，并于1975年重構出細菌視紫紅質蛋白模型，盡管這個模型現在看起來還遠不夠精細，但在當時已是冷凍電鏡技術解析出的最好結構(圖5)[17]。

圖5 1975年，Henderson第一次用冷凍電鏡技術得到的粗糙的細菌視紫紅質三維結構[17]

1990年，Henderson研究組第一次使用冷凍電鏡技術對同一樣品的多個拷貝進行平均計算得到了細菌視紫紅質蛋白的高分辨結構(圖6)，歷時15年，他最終證實了利用冷凍電鏡技術可以獲得生物大分子的高分辨結構的可行性。他們發現，在冷凍溫度下，可以用盡量低的電子劑量成像對樣品進行數據采集，獲得能夠滿足研究需求的蛋白氨基酸側鏈信息。這一突破性進展被認為是冷凍電鏡技術應用于大分子結構解析的里程碑[18]。

圖6 1990年，Henderson用冷凍電鏡解析出細菌視紫紅質近原子分辨率的三維結構[18]

在研究過程中，Henderson研究組試用了全世界范圍內的數臺電鏡以期提高數據質量，但發現了這些電鏡的技術局限以及樣品制備方法的不足，制約了圖像分辨率的提高[18]。盡管當時情況不容樂觀，但Henderson仍斷言利用低電子密度、無損電子輻照在高襯度電鏡下可以確定單個顆粒的二維位置和三維結構。他預言：隨著電鏡技術的發展和樣品制備水平的提高，冷凍電鏡技術一定能成為研究疑難樣品和非結晶生物大分子的有力工具，并會發展成為常規、快捷的研究手段[18]。

事實上，電子束照射導致的樣品損傷取決于電子劑量、樣品的溫度和電子束能量，生物樣品的性質決定了必須采用低劑量電子成像技術。在超低溫環境下觀察樣品，既解決了樣品含有水分的問題，也減少了電子輻照和溫度升高對生物樣品的損傷。可以根據研究目的來綜合考慮拍攝條件，例如：100 kV電壓，液氮溫度下適用的電子劑量一般是5～10 e-/ ?2；如果要獲得近原子級別的高分辨三維結構，則需要加速電壓達到300 kV，電子劑量一般要達到15～30 e-/ ?2[19]。 然而這樣的低劑量成像帶來的最大問題就是單張電鏡圖像的信噪比非常低，照片的襯度很差，導致獲得的圖像模糊。因此，新型的成像設備和強大的圖像處理系統對于冷凍電鏡技術的發展至關重要。

3)圖像處理技術

試想，在20世紀70年代的冷凍電鏡下觀察不染色、非結晶、非對稱、在溶解狀態下隨機分布的顆粒樣品會看到什么結果？Frank[20]在一篇研究報告里描述如下：“在充滿噪聲的背景中僅能看到模模糊糊的樣品”。他的研究工作正是從這里開始。

Frank等[21]提出了一種交叉相關函數的方法來校準低劑量電子輻照下拍攝的單分子圖像。定量分析結果表明，利用對樣品無損的電子輻照劑量獲取的信息可以對隨機分布的顆粒進行定位，通過對顆粒樣品圖像進行疊加和平均計算得到高分辨數據。這一方法的可行性在對負染的谷氨酰胺合成酶的研究過程中得以闡明。

對于均一非結晶樣品的圖像分析，難點在于每個顆粒的定位與定向，通常需要通過確定5個參數來判斷二維平面圖像的位置和三維結構的方向。然而，生物樣品大多含有雜質，異質性高，這就要求分析系統具備可以識別樣品潛在亞結構的能力以區分非均質樣品中不同類別的顆粒；在顆粒染色的情況下，還要能夠識別出負染的結構。1981年，Frank 和Marin van Heel提出了一種方法，可以根據顆粒的方向和結構特點對顆粒圖像進行分類[22-23]。計算機可以根據細微的差異將圖像自動分類，把顆粒分成不同的集群，每個集群代表一個具有特定位置和結構的顆粒的二維投影。在同一集群里不同顆粒被假定為具有足夠的相似性，允許進入疊加和平均值的計算，使信噪比得以提高。1986-1987年，Frank和Michael Radermacher建立了非對稱顆粒從二維投影到確定相應三維結構的方法——隨機圓錐傾斜法(Random Conical Tilt)[24-25]。可以說，Frank建立了初步的方法學體系，奠定了冷凍電鏡單顆粒三維重構的基本原理[26](圖7)。此外，Frank還發展了多種用于圖像分析的數學工具，將其匯總到一起開發出一系列計算機程序——SPIDER，用于單顆粒冷凍電鏡結構分析，并得到廣泛使用[27]。

綜上所述，經過30年的不斷改進和發展，冷凍電鏡技術取得了長足的進展，在樣品制備、成像和計算機處理等方面建立了理論基礎，完成了方法學和技術準備，圖像的分辨率也有了很大程度的提高。然而，研究者可以觀察到的二維投影圖像仍處于模糊狀態，這成為冷凍電鏡技術發展的瓶頸，限制了該技術的廣泛應用。

圖7 Frank建立的三維結構圖像分析技術示意圖[26]

2012-2013年間，電子直接探測相機(electron direct detection device，DDD)的應用，使冷凍電鏡技術突破了技術瓶頸，如虎添翼。DDD相機可以直接探測到高能電子，使信噪比和空間分辨率有了飛躍性的提高[28-29](圖8)。DDD相機的另一個優勢是采集信號速度快，某些情況下竟可以錄制“電影”，這一功能可以補償和矯正被觀察中的樣品由于電子輻照和熱漂移效應產生的位移[29]。

過去的幾年中電鏡的分辨率得到顯著提高，過去僅能看到蛋白分子模糊呈泡狀結構，現在則可以看到原子水平分辨率的精細結構[29]。

成像技術上取得突破后，在短時間內解析出了多個蛋白的高分辨結構。2013年，美國加州大學舊金山分校程亦凡實驗室率先利用直接電子探測器解析了約700 000(～15 nm)的蛋白酶體的結構，分辨率達3.3 ?[30]；同年解析了約300 000的膜蛋白辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid type-1，TRPV-1)四聚體結構，分辨率達3.4 ?[31]。美國國立衛生研究院Subramaniam實驗室解析了334 000的谷氨酸脫氫酶的結構，分辨率達1.8 ?，這是到目前為止用單顆粒分析法解析的最高分辨率的蛋白結構[29]。

2015年，清華大學施一公研究團隊報道了分辨率高達3.4 ?的人γ-分泌酶的三維結構，并且基于結構分析研究了γ-分泌酶致病突變體的功能，為理解γ-分泌酶的工作機制以及阿爾茨海默癥的發病機制提供了重要依據[32]。隨后他們又發表了“3.6 ?分辨率的酵母剪接體結構”和“前體信使RNA剪接的結構基礎”兩篇論文。由于動態性強，剪接體的研究一直以來被認為是極為困難的課題，然而借助冷凍電鏡技術，能夠看到凍結在運動中的生物分子，并且將其運動過程視覺化呈現出來，這是人類前所未見的成果[33-34]。因此，該研究在國內引起了不小的轟動。

2016和2017年，清華大學楊茂君課題組用冷凍電鏡方法成功解析了線粒體呼吸鏈復合體的三維結構，為進一步理解其生物學功能奠定了基礎[35-36]。

如今，冷凍電鏡技術正如Henderson在20年前所預言，應用范圍越來越廣，解析的蛋白越來越小，并幫助科學家們解決了越來越多歷史性的難題。

3 意義、啟示與展望

冷凍電鏡技術的發展歷經了30年。1990年，用此技術解析出第一個蛋白高分辨結構；2012至2013年，DDD相機的應用使這項技術突破技術瓶頸，解析出更小分子質量蛋白的高辨率三維結構。本技術的建立、發展和廣泛應用該歸功于Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson在各自領域為此做出的貢獻，他們的工作人們使對生命分子的研究進入原子水平的時代。

與X線晶體衍射和磁共振相比，單顆粒冷凍電鏡技術具有無可比擬的優勢，這項技術不需要蛋白結晶，只需要少量的蛋白樣品，并且適合于不同大小的樣品，例如小到64 000的血紅蛋白，大到幾兆道爾頓的大顆粒。冷凍電子斷層技術甚至可用于更大的生物樣品，例如組織器官和細胞，可獲得大分子及其復合物在細胞或組織中原位的高分辨圖像和結構[37-38]。

冷凍電鏡技術的另一優勢是，它呈現的不僅僅是靜態結構。冷凍電鏡的樣品制備可在瞬間完成，可以捕捉到蛋白分子動態的變化[39-40]。或許將來人們可以在細胞或組織器官內原位觀察到分子間相互作用及其動態變化過程。

盡管這次諾貝爾化學獎主要是褒獎3位科學家在單顆粒冷凍電鏡技術方面所作出的貢獻，但并不意味著這項技術已經非常成熟或完善。事實上，還有很多問題需要繼續思考和探索，例如：冷凍樣品制備方案的優化、“分子機器”動態結構的解析、解析后大分子的功能研究等。另外，冷凍電鏡技術應用于細胞、組織乃至器官領域還有很多空白，例如生物大分子甚至細胞器在細胞原位的三維結構、相互作用、活動等等。通過對處于不同狀態的蛋白分子結構解析來研究和闡明其功能，可以從原子水平揭示生命的密碼，從而推動基礎醫學研究、疾病預防及治療和高效藥物的開發，造福人類。

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Cryo-electronmicroscopycapturelifeinatomicdetails—the2017NobelPrizeinChemistry

Yang Hui, Li Shentao, Xue Bing*

(CoreFacilityCenter,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

The Royal Swedish Academy of Sciences has announced that the Nobel Prize in Chemistry 2017 was awarded to Jacques Dubochet, Joachim Frank and Richard Henderson for their developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination of biomolecules in solution.

the 2017 Nobel Prize in Chemistry；cryo-electron microscopy；high-resolution structure determination of biomolecules

*Corresponding authors， E-mail：xuebing_bj@126.com

時間：2017-10-14 16∶19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1619.044.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.027]

2017-10-12)

編輯 陳瑞芳