大鼠腸道菌群對羊耳菊提取物的代謝作用研究

鞏仔鵬+侯靖宇 李梅 吳林霖 陳亭亭 李勇軍+王愛民 蘭燕宇+王永林

[摘要]考察大鼠腸道菌群對羊耳菊提取物中主要成分的代謝作用，將羊耳菊提取物與大鼠腸道菌液在厭氧條件下共同孵育24 h，通過正丁醇液液萃取處理后，采用色譜聯用技術（UPLCQTOFMS/MS）對代謝產物進行定性分析，并結合布魯克公司研發的數據處理工具Metabolite Tools，Data Analysis等對代謝信息進行綜合分析。通過比較空白樣品圖譜，腸菌樣品圖譜以及兩者的差異圖譜，各色譜峰的準分子離子，碎片離子，分析羊耳菊提取物在大鼠腸道菌群作用下可能產生的代謝產物。結果提示，羊耳菊提取物在腸道菌群作用下，檢測到14個代謝產物，主要包括單咖啡?；鼘幩岬漠悩?，水解的小分子化合物和咖啡酸的還原，甲基化和乙?；却x產物，同時僅檢測到1個二咖啡酰基奎寧酸的甲基化代謝產物。以此推測，咖啡?；鼘幩犷惓煞衷谀c道菌群的作用下可能多數水解為分子量小，疏水性更強的代謝產物，使得其更容易被腸道吸收。

[關鍵詞]羊耳菊提取物； 腸道菌群； 代謝產物； UPLCQTOFMS/MS

Metabolism of Inula cappa extract by rat intestinal bacteria in vitro

GONG Zipeng1，2，3，4， HOU Jingyu1，2，3，4， LI Mei1，2，3，4， WU Linlin1，2，3，4， CHEN Tingting1，2，3，4，

LI Yongjun1，2，3，4， WANG Aimin1，2，3，4， LAN Yanyu1，2，3，4， WANG Yonglin1，2，3，4*

（1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；

2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine

（Ministry of Education）， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；

3. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；

4. National Engineering Research Center of Miao′s Medicines， Guiyang 550004， China）

[Abstract]To investigate the metabolism of major components in Inula cappa by rat intestinal bacteria in vitro I cappa extract was incubated for 24 h with rat intestinal bacteria under anaerobic environment After the samples were precipitated by nbutanol， UPLCQTOFMS/MS was applied for the qualitative analysis of the metabolites， combined with data software such as Metabolite Tools， Data Analysis and so on The potential metabolites in rat intestinal bacteria were analyzed by comparing the total ion current of the test samples and blank samples and analyzing the quasimolecular ion and fragment ion of all chromatograms The results injected that fourteen metabolites were detected in rat intestinal flora Various types of metabolic reactions happen to caffeoylquinic acid in intestinal flora， including isomerization， hydrolyzation， there were also methylation， hydrogenation and acetylation of caffeic acid At the same time， a methylate of dicaffeoylquinic acid was also detected Presumably， caffeoylquinic acids were gradually transformed into more hydrophobic metabolites with smaller molecular mass， which were better absorbed by the intestinal tract.

[Key words]Inula cappa extracts； intestinal bacteria； metabolites； UPLCQTOFMS/MS

中藥及其制劑的給藥方式多數以口服為主，在胃腸道被吸收后分布到靶器官從而發揮療效，再經代謝作用最后排出體外。胃腸道不僅是藥物吸收的主要部位，同時對藥物也有一定的代謝作用，部分難以吸收的藥物可能在腸道菌群的作用下轉變為易吸收的成分，因此腸道菌群對藥物療效的發揮起到了重要的作用。并且中藥及其制劑成分復雜，在體內的代謝過程和作用機制尚不明確，直接口服給藥后，研究其體內過程和直接藥效物質比較困難，因此選擇腸道菌群體外代謝實驗，研究民族藥羊耳菊中主要藥效物質的體外代謝規律，能夠為藥材的體內過程研究奠定一定基礎[14]。endprint

羊耳菊為貴州苗族及云南傣族等少數民族常用藥物，常用于感冒發熱，咽喉腫痛等癥，有獨特療效[5]。羊耳菊中含有較多的咖啡?；鼘幩狨ヮ惢衔颷67]，文獻報道咖啡酰基奎寧酸酯類化合物有突出的抗菌、抗病毒活性[89]。而這類物質較不容易被吸收，因此容易可在腸道菌群作用下部分水解，發生一系列反應形成小分子物質后被吸收入血發揮其藥理作用[1011]。盡管國內外有較多研究報道單體咖啡?；鼘幩犷惓煞值拇x特征，但鮮有羊耳菊提取物中此類成分的體外腸道菌群代謝相關報道，且中藥提取物成分復雜，對此類成分的代謝過程可能也有所影響，因此本實驗采用離體法來研究羊耳菊提取物中的主要代謝產物，研究其在大鼠腸道菌群中的代謝情況，依此來推測羊耳菊提取物的腸道菌群代謝途徑，對指導臨床合理用藥和羊耳菊藥材新劑型的研發，具有重要的意義。

1材料

11儀器

CDH6000B Ⅱ電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SWCJ2FD 超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）；YXQLS18SI 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司）；厭氧產氣袋（AnaeroPackAnaero，MGC，日本三菱瓦斯化學株式會社）；厭氧培養罐（PackRectangular Jars，日本三菱瓦斯化學株式會社）；超高壓效液相色譜四極桿飛行時間串聯質譜儀（Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統， 布魯克道爾頓四極桿飛行時間質譜儀）；Allegra 64R低溫高速離心機（Beckman Coulter）；MTN2800D氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

12試藥

羊耳菊藥材購自貴州龍里縣，由貴州醫科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inula cappa（BuchHam） DC的干燥全草。綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753201415），新綠原酸（批號X2020141012）、隱綠原酸（批號Y5820141012）、1，3O二咖啡酰基奎寧酸（批號1384101215）、3，4O二咖啡酰基奎寧酸（批號1384101215）、3，5O二咖啡酰基奎寧酸（批號S34110121）、4，5O二咖啡酰基奎寧酸對照品（批號1384101215）均購于中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心。

13動物

健康SD大鼠，雌雄兼用，體質量（250±20）g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，合格證號SCXK （渝）20150001。

2方法

21色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（21 mm×100 mm，18 μm）；柱溫40 ℃；流動相為01%甲酸乙腈（A）01%甲酸水（B）；進樣體積為5 μL；流速03 mL·min-1。梯度洗脫條件：0～1 min，5% ～10% A；1～13 min，10%～28%A；13～16 min，28%～100% A；16～17 min，100% A；17～18 min，100%～5% A。

22質譜條件

電噴霧離子源；掃描方式為負離子掃描（ESI-，m/z 50～1 000）；毛細管電壓35 kV；離子源溫度200 ℃；霧化氣（N2）壓力12 bar；干燥氣溫度200 ℃；氣體體積流量6 L·min-1；準確質量測定采用甲酸鈉校正標準液；校正模式選用Enhanced Quadratic；數據分析采用Data Analysis軟件、Metabolite Tools等。

23羊耳菊有效組分提取物的制備

通過實驗室前期藥效學篩選試驗，確定羊耳菊有效組分的提取方式。取羊耳菊藥材12 kg，充分混勻，取10倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并3次濾液，減壓濃縮，回收乙醇，得12 L濃縮液。上述濃縮液用D101大孔樹脂吸附（徑高比1∶4），加水洗脫至流出液無顏色后，再用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，得浸膏，微波真空干燥即得提取物，得膏率為7%。各主要成分的質量分數分別為1，3O二咖啡?；鼘幩?01%，3，4O二咖啡酰基奎寧酸382%，3，5O二咖啡?；鼘幩?56%，4，5O二咖啡?；鼘幩?87%，新綠原酸217%，綠原酸099%，隱綠原酸336%，-4 ℃條件干燥保存，備用。

24供試液樣品的制備

稱取提取物粉末1 g，精密稱定，加入10 mL 50%甲醇水，超聲10 min，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得，備用。

25對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸等7種對照品，于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容。得綠原酸0740 g·L-1、新綠原酸1032 g·L-1、隱綠原酸1026 g·L-1、1，3O二咖啡?；鼘幩?064 g·L-1、3，4O二咖啡?；鼘幩?032 g·L-1、3，5O二咖啡?；鼘幩?194 g·L-1、4，5O二咖啡?；鼘幩?204 g·L-1的對照品溶液。-20 ℃保存，備用。

26樣品處理方法

將腸菌樣品分別轉入進口50 mL離心管中，每管加入10 mL正丁醇，渦旋混合5 min，萃取3次，合并3次正丁醇層萃取液，6 000 r·min-1離心5 min，上清液37 ℃下N2吹干，殘渣加入1 mL正丁醇溶解，渦旋混合3 min，超聲5 min，15 000 r·min-1 離心10 min，上清液37 ℃下N2吹干，殘渣用200 μL 50%甲醇水溶解，渦旋混合3 min，超聲5 min，15 000 r·min-1離心10 min，上清液進樣UPLCQTOFMS/MS分析。

27羊耳菊活性部位大鼠腸道菌群代謝[12]endprint

271大鼠腸道菌液的制備健康大鼠脫頸處死后，迅速開腹，取結腸段內容物，將其與生理鹽水按1∶4混懸，4 000 r·min-1離心10 min后得到上清液，即為腸道菌液。取80 mL菌液，加入720 mL無血清厭氧培養液中，得到腸菌培養液。

272腸菌實驗取上述腸菌培養液8 mL，分為4份，再分別加入6 mL已滅菌的厭氧培養液，混勻，置于厭氧條件下培養24 h，培養好后，向其中3份加入已過濾除菌的羊耳菊活性部位厭氧培養液溶液（05，10，20 g·L-1），另1份加入空白厭氧培養液作對照。另取厭氧培養液34 mL，平均分為3份于培養皿中，向其中加入已過濾除菌的羊耳菊提取物厭氧培養液溶液（05，10，20 g·L-1），作為不加腸菌的空白對照組。將上述7份培養皿置于37 ℃，厭氧條件下培養24 h，所得樣品按26項下處理，進樣UPLCQTOFMS/MS分析。

3結果

31UPLCQTOFMS/MS色譜采集

根據建立的方法，首先運用布魯克道爾頓公司的Metabolite Predict軟件對單咖啡酰基奎寧酸類（綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸）和二咖啡酰基奎寧酸類（1，3O二咖啡酰基奎寧酸，3，4O二咖啡?；鼘幩?，3，5O二咖啡?；鼘幩?，4，5O二咖啡?；鼘幩幔┑瘸煞诌M行代謝產物預測，將生成的代謝產物的Masslist導入Metabolite Detect軟件，結合對照品，質譜碎片信息和相關文獻得到其可能的代謝產物，推測羊耳菊提取物中各成分在體內可能的代謝途徑。

32羊耳菊提取物在腸道菌群中的代謝

由Metabolite Detect得到空白腸菌孵育樣品，提取物腸菌孵育樣品，厭氧培養液孵育樣品（未加腸菌）及差異圖譜見圖1。由圖1的C圖可知羊耳菊提取物在空白厭氧培養液中不干擾代謝產物的測定。

33羊耳菊提取物在腸道菌群中代謝產物的鑒定分析

由Metabolite Detect對樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜以及響應的質譜碎片，并結合文獻[1314]，對羊耳菊提取物中部分代謝產物進行分析，代謝產物見表1，各代謝產物初步分析如下。

M1由差異圖譜中可知，tR=32 min色譜峰的準分子離子為m/z 181051 1[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C9H9O4，比咖啡酸負離子多2個H，丟失1分子CO，產生m/z 137060 2 [M-H-CO]-的碎片，因此推測M1為咖啡酸雙

鍵還原后的產物二氫咖啡酸。并且咖啡酸可能為咖啡?；鼘幩崴夂蟮漠a物。

M2由差異圖譜中可知，tR=34 min色譜峰的準分子離子為m/z 137025[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C7H5O3，分子式與羥基苯甲酸一致，故推測M2可能為咖啡酸的水解產物羥基苯甲酸，本實驗數據不能說明取代基的位置，有待進一步研究。

M3由差異圖譜中可知，tR=39 min色譜峰的準分子離子為m/z 151051 7[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C8H8O3，分子式與羥基苯乙酸一致，故推測M3可能為咖啡酸的水解產物羥基苯乙酸，本實驗數據不能說明取代基的位置，有待進一步研究。

M4由差異圖譜中可知，tR=42 min色譜峰的準分子離子為m/z 353088 4 [M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C16H17O9，主要碎片離子為m/z 191055 2[M-H-C9H6O3]-，碎片離子和分子式與單咖啡酰基奎寧酸一致，但保留時間與綠原酸，新綠原酸，隱綠原酸對照品均不一致，并且本實驗數據不能說明取代基的位置，有待進一步研究，故推測M4可能為單咖啡?；鼘幩狨ユI位置異構的代謝產物。

M5由差異圖譜中可知，tR=53 min，色譜峰的準分子離子為m/z 165055 9 [M-H]-，由SmartFormula軟件預測化學式為C9H9O3，分子式與羥基苯丙酸一致，但本實驗數據無法確定說明取代基的位置，故推測M5可能為咖啡酸的水解產物羥基苯丙酸。

M6由差異圖譜中可知，tR=58 min色譜峰的準分子離子為m/z 353088 4[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C16H17O9，主要碎片離子為m/z 191050 [M-H-C9H6O3]-，碎片離子和分子式與M4一致，可能M6與M4互為同分異構體，由于本實驗數據不能說明取代基的位置，有待進一步研究，故推測M6同樣可能為單咖啡酰基奎寧酸酯鍵位置異構的代謝產物。

M7由差異圖譜中可知，tR=62 min色譜峰的準分子離子為m/z 529131 3[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C26H25O12，比二咖啡酰基奎寧酸多14，同時丟失CH2，產生的主要碎片離子為m/z 515119 7 [M-H-CH2]-，提示有甲基化反應，由于本實驗數據不能說明取代基的位置，無法判斷M7由哪個二咖啡?；鼘幩峒谆a生，故推測M7可能為二咖啡?；鼘幩岬膯渭谆a物，具體取代基位置有待進一步研究。

M8由差異圖譜中可知，tR=70 min色譜峰的準分子離子為m/z 195066 3[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C10H11O4，分子式比阿魏酸負離子m/z 193 （C10H8O4）多2個H，中性丟失CO2，產生的主要碎片離子為m/z 151076 0 [M-H-COO]-，由于本試驗數據不能說明取代基的位置，且提取物中存在較多單咖啡酰基奎寧酸和二咖啡?；鼘幩岬耐之悩嬻w，無法判斷阿魏酸由哪個咖啡?；鼘幩崴舛鴣?，故推測M8可能為咖啡?；鼘幩崴猱a生的阿魏酸的還原產物二氫阿魏酸。endprint

M9由差異圖譜中可知，tR=76 min色譜峰的準分子離子為m/z 337094 2 [M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C16H17O8，主要碎片離子為m/z 191049 8 [M-H-C9H6O2]-，173044 2 [M-H-C9H8O3]-的碎片，分子式和碎片離子與香豆?？鼘幩嵋恢?，但本試驗數據無法確定其取代基的結合位點，故推測M9可能為香豆酰奎寧酸，有待進一步研究。

M10由差異圖譜中可知，tR=79 min色譜峰的準分子離子為m/z 285041 3 [M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C15H19O6，分子式與木犀草素一致，但提取物中并無木犀草素原型存在，故推測M10可能為提取物中木犀草苷類成分水解產生的木犀草素。

M11由差異圖譜中可知，tR=84 min色譜峰的準分子離子為m/z 207065 3 [M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C11H11O4丟失CH2，產生的主要碎片離子為m/z 193050 8 [M-H-CH2]-，149060 1 [M-H-COO]-，提示存在甲基化反應，而主要碎片離子與阿魏酸一致，故推測M11可能為阿魏酸甲基化產物。

M12由差異圖譜中可知，tR=90 min，色譜峰的準分子離子為m/z 225045 4 [M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C11H11O5，丟失42，產生主要碎片離子為m/z 183050 8 [M-H+4HCOCH3]-，表明存在乙酰化反應，比咖啡酸多4個H，同時存在還原反應，故推測M12可能為咖啡酸還原后的乙酰化產物。

M13由差異圖譜中可知，tR=93 min，產生的準分子離子峰為m/z 165056 0[M-H]-，由Smart Formula軟件預測化學式為C9H9O3，與M5分子式與一致，但保留時間不同，故推測M13與M5互為同分異構體，但本實驗數據無法確定其取代基的結合位點，故推測M13可能為咖啡酸的水解產物羥基苯丙酸。

34羊耳菊提取物主要成分在腸道菌群中可能的代謝途徑

羊耳菊提取物在腸道菌群中的代謝以提取物中含量較高的咖啡?；鼘幩犷惓煞值拇x為主，但由于提取物中同時存在單咖啡酰基奎寧酸和二咖啡?；鼘幩岬耐之悩嬻w，本試驗所得數據無法準確明確其具體取代基的位置。因此，以綠原酸和3，4O二咖啡?；鼘幩釣槔?，分析提取物中主要成分可能的代謝產物及代謝途徑，見圖2～4。

4結論

本試驗采用UPLCQTOFMS/MS技術方法，較于一般的四極桿質譜檢測器，在負離子模式下對樣品進行測定，具有靈敏度高，掃描范圍廣，快速簡便等特點，同時針對不同化合物產生不同的質譜碎片，使檢測更具有精度，大大降低了基質干擾。同時采用布魯克公司的Metabolite ToolsTM對代謝信息進行分析。其中Metabolite Predict含有Metabolite Rules（代謝途徑庫），根據藥物中原型成分的結構特征及其在體內可能發生的代謝變化，選擇相應的代謝途徑，由此Metabolite Predict則會預測出龐大的代謝產物Masslist；將Masslist導入至Metabolite Detect中，與差異圖譜進行匹配，通過差異分析并結合MDF技術來尋找到可能的代謝產物并對其進行定性[15]。

在本試驗中，腸菌孵育樣品中檢測13個代謝產物，主要包括單咖啡?；鼘幩岬漠悩嫽?，水解的小分子化合物和單咖啡酰基奎寧酸水解后產生的咖啡酸的還原，甲基化和乙?；却x產物。在代謝產物中僅檢測到二咖啡酰基奎寧酸類成分的甲基化產物，可能是由于其在腸道菌群的作用下水解成單咖啡?；鼘幩峄蛘呖Х人岬刃》肿拥奈镔|再進行進一步的代謝反應。綜合腸道菌群實驗結果，說明在中藥提取物中的咖啡?；鼘幩犷愇镔|，在體內吸收的過程中，可能會被腸道菌群代謝為小分子量的物質，如苯甲酸、苯乙酸等，再被吸收進入體內，從而影響咖啡?；鼘幩犷愇镔|的生物利用度。

咖啡?；鼘幩犷惣淳G原酸類物質作為多種中藥的主要活性物質，因其具有廣泛的生物活性，一直以來是國內外研究的熱點[10]，研究發現，綠原酸在人體內通過腸道微生物如大腸桿菌、雙歧桿菌和加氏乳桿菌產生的酯酶的作用下發生水解形成咖啡酸和奎尼酸，還會發生酯基位置異構，再經腸道微生物作用脫羥基形成香豆酸，也可經還原酶（RA）發生氫化作用。二氫咖啡酸也可能會發生C4位脫羥基作用生成3（3′羥苯基）丙酸，或經輔酶 A（CoA）介導脫去1個亞甲基形成3，4二羥基苯乙酸。3，4二羥基苯乙酸迅速脫亞甲基轉化為 3，4二羥基苯甲酸等。人體中腸道菌群的分布與大鼠相類似，提取物中的綠原酸類成分也發生了相類似的代謝反應，生成了苯丙酸，苯乙酸，苯甲酸等代謝產物，說明羊耳菊提取物在腸道菌群中的代謝，可能與大腸桿菌、雙歧桿菌等菌類和輔酶A等酶密切相關。

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[責任編輯張燕]endprint