林可霉素工業生產發酵工藝優化

謝 婷，武 培*，韓德全，馬朝安，張增輝，李勝利，趙曉強

（天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000）

林可霉素工業生產發酵工藝優化

謝 婷，武 培*，韓德全，馬朝安，張增輝，李勝利，趙曉強

（天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000）

為了提高林可霉素工業生產發酵效價，該研究對林可霉素發酵工藝進行了優化。結果表明，林可霉素最佳發酵條件為二級種子罐發酵培養基中淀粉和黃豆餅粉添加量分別為0.97%和1.43%、延長二級種子移種菌齡至48 h及四級發酵罐基礎料計料體積為8 m3。在此優化發酵工藝條件下，林可霉素發酵四級放罐效價高達7 505 U/mL，比原始工藝四級放罐效價提高了16%。初步優化了林可霉素工業生產發酵工藝，提高了林可霉素發酵效能和產量。

林肯鏈霉菌；林可霉素；工業生產；發酵工藝優化

林可霉素又稱林肯霉素、潔霉素，是由林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）通過好氧發酵產生的一種廣譜抗生素，屬于林可酰胺類素[1-4]。林可霉素及其衍生物是一類通過抑制菌體中蛋白質的合成而起作用的藥物，是一種較有前途的抗生素。臨床上適用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染，對革蘭氏陰性菌也有效[5-7]。林可霉素用藥途徑較多，副反應較少，適用于青霉素過敏的病人，己成為臨床應用上主要的抗生素之一[8-10]。

目前對林可霉素的研究主要集中在培養基優化、無機鹽或前體等物質添加、物料研究以及發酵過程控制等方面[11-16]。研究發現，林可霉素發酵生產培養基中主要碳源為淀粉和葡萄糖，葡萄糖濃度過低時會明顯影響菌體的生長，濃度過高時又會產生葡萄糖效應，從而會降低林可霉素的產量，葡萄糖效應并不是葡萄糖本身所產生的作用，而是其分解產物所致，所以在發酵過程中，選擇緩慢利用的碳源，保持低濃度的葡萄糖，是避開葡萄糖效應的一種有效的方法；氮源中的黃豆餅粉降解為氨基酸或氨的速率很慢，而不至于會阻遏抗生素的合成，因此，在林可霉素的發酵生產中常用其作為氮源；pH影響林可霉素的合成，在弱堿性的環境中，有利于林可霉素的生物合成；林肯鏈霉菌為好氧菌，轉速控制在150～190 r/min時，不但能提高發酵體系溶解氧濃度，而且不會使菌絲體過分斷裂[17-21]。

國內外對林可霉素搖瓶培養階段和發酵罐發酵階段研究較多。國內發酵小試或中試一般以二級發酵為主，工業生產多采用三級發酵[22-23]。林可霉素的發酵過程可分為初期（0～24 h）、前期（24～48 h）、中期（48～140 h）和發酵后期（140 h至發酵終點）[24-25]。國內林可霉素生產工藝普遍采用分批補料，分批補料培養基中通常含葡萄糖、玉米漿、黃豆餅粉及一些金屬離子。這些成分在發酵過程中可防止菌絲生長過盛或延緩菌體衰老，延長菌體產生林可霉素的時間，大幅提高林可霉素的效價[22]。

本研究通過考察二級種子罐發酵培養基中碳源和氮源、二級種子移種菌齡及四級發酵罐基礎料計料體積對林肯鏈霉菌四級發酵產林可霉素的影響，優化林可霉素工業生產發酵工藝條件，以期能通過基礎研究解決林可霉素工業生產實際問題，提高發酵效能和產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）：由天方藥業有限公司提供。

1.1.2 培養基

斜面培養基：淀粉2.11%，黃豆粉餅0.50%，FeSO4·7H2O 0.001%，KNO30.09%，K2HPO40.04%，MgSO4·7H2O 0.40%，NaCl 0.07%，瓊脂2.00%，pH值為7.00。

搖瓶培養基：淀粉2.11%，黃豆粉餅1.58%，葡萄糖1.60%，玉米漿3.00%，（NH4）2SO40.15%，CaCO30.40%，pH值為7.00。

一級種子罐培養基：淀粉0.45%，黃豆粉餅1.00%，葡萄糖3.00%，玉米漿1.45%，（NH4）2SO40.06%，NaNO30.43%，KH2PO40.03%，CaCO30.95%，NaCl 0.65%，片堿0.10%，NH4NO30.30%，泡敵0.08%，消泡劑0.09%，pH值為7.00。

二級種子罐培養基：淀粉0.87%，黃豆粉餅1.33%，葡萄糖3.80%，玉米漿1.33%，（NH4）2SO40.40%，NaNO30.63%，KH2PO40.03%，CaCO30.75%，NaCl 0.71%，片堿0.10%，NH4NO30.40%，泡敵0.04%，消泡劑0.06%，pH值為7.00。

三級種子罐培養基：淀粉0.50%，黃豆粉餅1.35%，葡萄糖6.30%，玉米漿1.50%，（NH4）2SO40.45%，NaNO30.50%，KH2PO40.03%，CaCO30.80%，NaCl 0.88%，片堿0.10%，NH4NO30.45%，泡敵0.04%，消泡劑0.03%，pH值為7.00。

四級發酵罐培養基：淀粉0.44%，黃豆粉餅1.32%，葡萄糖6.50%，玉米漿1.32%，（NH4）2SO40.44%，NaNO30.44%，KH2PO40.03%，CaCO30.74%，NaCl 0.81%，片堿0.10%，NH4NO30.44%，泡敵0.04%，消泡劑0.03%，pH值為7.00。

大稀料培養基：黃豆粉餅10.00%，玉米漿13.00%，CaCO30.40%，泡敵0.08%，消泡劑0.08%，pH值為5.00。

以上培養基滅菌條件：121℃，30 min。

液化糖：淀粉30.00%，淀粉酶0.60%，液化酶0.60%，硫酸銨1.80%，115℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

HI2211pH計：北京哈納儀器廠；TDL-80-2B臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠；GZF-GF101-BS干燥箱：上海躍進醫療器械廠；XWW25/450旋轉搖瓶機：樂山三九長征藥業股份有限公司；XG1.X（Y）中型壓力滅菌器：山東新華醫療器械廠；一級（2 m3）、二級（20 m3）、三級（70 m3）和四級（100m3）發酵罐：武漢同創工程設備有限公司；CX31-12L02顯微鏡：南京庚辰科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 林可霉素四級發酵工藝流程

林可霉素的發酵工藝為四級發酵，其發酵工藝流程如下：

操作要點：

種子搖瓶培養：挖取斜面培養基上1 cm2左右的菌塊，接種于裝有100mL種子培養基的1000mL三角瓶中，30℃、220 r/min培養40～50 h，接種pH為7.00～7.40。

一級種子罐：0.10%的接種量，30℃，培養40～50 h，移種pH值為7.00～7.40。

二級種子罐：10～15%的接種量，30℃，培養20～50 h，移種pH值為7.00～7.40。

三級種子罐：15～30%的接種量，30℃，培養45～70 h，移種pH值為7.00～7.40。

四級發酵罐：30～40%的接種量，30℃，培養150～180h；稀料：30 h后每8 h補一次，每次1～3 m3；補糖：接種后至放罐整個發酵體系中還原糖控制在0.20～1.80%；調節pH值為6.40～7.00。1.3.2培養方法

（1）二級種子罐發酵培養基中碳源的優化

在原二級種子罐發酵培養基碳源基礎上優化淀粉的濃度，比較二級種子罐發酵培養基中淀粉含量分別為0.77%、0.87%、0.97%和1.07%時后續四級放罐效價，以原二級種子罐發酵培養基淀粉含量0.87%為對照，確定林肯鏈霉菌產林可霉素的二級種子罐發酵培養基中淀粉的最優濃度。

（2）二級種子罐發酵培養基中氮源的優化

在已優化淀粉濃度以及原二級種子罐發酵培養基中氮源的基礎上優化黃豆餅粉的濃度，比較二級種子罐發酵培養基中黃豆餅粉含量分別為1.23%、1.33%、1.43%和1.53%時后續四級放罐效價，以原二級種子罐發酵培養基黃豆餅粉濃度1.33%為對照，確定林肯鏈霉菌產林可霉素的二級種子罐發酵培養基中黃豆餅粉的最優濃度。

（3）二級種子移種菌齡的確定

采用管道壓差法對二級種子罐接種后，考慮到工業生產四級發酵各階段時間銜接以及生產成本，將二級種子移種菌齡由26 h延長至48 h。通過比較二級種子移種時發酵液菌濃和四級放罐效價，確定林肯鏈霉菌產林可霉素的二級種子移種菌齡。

（4）發酵罐基礎料計料體積的優化

在已優化工藝的基礎上，比較發酵罐基礎料計料體積分別為6 m3、8 m3和10 m3時四級發酵罐發酵過程中發酵液的效價，確定較優的四級發酵罐基礎料計料體積。

1.3.3 測定方法

（1）菌體生長量—菌濃的測定

取10 mL發酵液倒入10 mL離心試管中，2 500 r/min離心5 min，取上清液的體積，記作A，計算菌體的濕菌濃（簡稱菌濃），菌濃計算公式如下：

（2）發酵液效價的測定

發酵液效價的測定：采用管碟法[6]。

2 結果與分析

2.1 二級種子罐發酵培養基中碳源的優化

圖1 不同的淀粉添加量對林肯鏈霉菌產林可霉素的影響Fig.1 Effects of different starch addition on lincomycin production byS.lincolnensis

由圖1可知，四級放罐效價隨著二級種子罐發酵培養基中淀粉添加量的增加而增加，當培養基中淀粉添加量為0.97%時，林可霉素四級放罐效價達到最大值6 593 U/mL，比原二級種子罐發酵培養基中淀粉添加量為0.87%（對照）時的四級放罐效價（6477U/mL）提高了116 U/mL；當培養基中淀粉濃度為1.07%時，林可霉素四級放罐效價反而降低，僅為6 405 U/mL，比對照組效價低了72 U/mL。可見，當二級種子罐發酵培養基中淀粉濃度較低時，不能給菌體提供足夠的碳源，影響菌體生長；當培養基中淀粉濃度高時，淀粉將大量轉化成葡萄糖后產生了葡萄糖效應，限制了菌體生長，二者皆會導致后續發酵四級放罐效價降低。因此，二級種子罐發酵培養基中淀粉添加量為0.97%時較優。

2.2 二級種子罐發酵培養基中氮源的優化

圖2 不同的黃豆餅粉添加量對林肯鏈霉菌產林可霉素的影響Fig.2 Effects of different soybean cake powder addition on lincomycin production byS.lincolnensis

由圖2可知，四級放罐效價隨著二級種子罐發酵培養基中黃豆餅粉添加量的增加而增加，當培養基中黃豆餅粉添加量為1.43%時，林可霉素四級放罐效價達到最大值6725U/mL，比原二級種子罐發酵培養基中黃豆餅粉添加量為1.33%（對照）時的四級放罐效價（6 587 U/mL）提高了132 U/mL；當培養基中黃豆餅粉添加量為1.53%時，林可霉素四級放罐效價反而降低，僅為6 605 U/mL。可見，當二級種子罐發酵培養基中黃豆餅粉添加量較低時，不能提供給菌體足夠的氮源，影響了菌體生長；當培養基中黃豆餅粉添加量高時，黃豆餅粉大量降解成為氨基酸或氨，使得營養過剩，高滲透壓限制了菌體的生長，二者皆會導致后續發酵四級放罐效價降低。因此，二級種子罐發酵培養基中黃豆餅粉添加量為1.43%時較優。

2.3 二級種子移種菌齡對林肯鏈霉菌產林可霉素的影響

圖3 移種菌齡對林肯鏈霉菌產林可霉素的影響Fig.3 Effect of transplanting cell age on lincomycin production by S.lincolnensis

由圖3A可知，二級種子移種菌齡由26 h延長至48 h，移種時發酵液菌濃由38%提高至46%，提高了21%。由圖3B可知，四級放罐效價也明顯提高，從6 720 U/mL提高至7 117 U/mL，提高了397 U/mL。可見，二級種子移種菌齡由26 h延長至48 h，提高了二級種子移種時發酵液菌濃，同時無菌檢驗批次增加，降低了種子液帶菌的風險；較高的種子菌體濃度，縮短了種子在發酵罐中的適應期，促進了后續發酵效價的提高。因此，二級種子移種菌齡48 h時較優。

2.4 發酵罐基礎料計料體積對林肯鏈霉菌產林可霉素的影響

圖4 計料體積對林肯鏈霉菌產林可霉素的影響Fig.4 Effect of material volume on lincomycin production by S.lincolnensis

由圖4可知，四級發酵罐發酵過程中發酵液效價的整體趨勢是隨著發酵周期的延長而升高，發酵液效價隨著基礎料計料體積的增加先升高后降低。四級發酵罐基礎料計料體積為8 m3時，發酵效價整體較高，且162 h（放罐）效價為7 505 U/mL，比計料體積為6 m3和10 m3時的放罐效價（7 236 U/mL和7 361 U/mL）分別提高了269 U/mL和144 U/mL，同時比原始工藝四級放罐效價（6 477 U/mL）提高了16%。由此可見，菌體生長需要一定的營養和能量，若計料體積低，則提供給林肯鏈霉菌的能量和營養會相對較少，在一定程度上會限制菌體生長，菌絲質量差，效價則會受到影響；若計料體積高，則過剩的碳源分解成大量葡萄糖會造成葡萄糖效應，同時過剩的氮源大量降解為氨基酸或氨又會阻遏抗生素的合成。因此，在現有工藝條件下，四級發酵罐基礎料計料體積為8 m3時較理想。

3 結論

林可霉素是一類具有重要臨床意義的高效廣譜抗生素，為了提高林可霉素工業生產效價，本研究通過采取優化林可霉素發酵工藝條件。結果表明，最佳發酵工藝條件為二級種子罐發酵培養基中淀粉和黃豆餅粉的添加量分別為0.97%和1.43%、延長二級種子移種菌齡至48 h及優化四級發酵罐基礎料計料體積為8 m3。優化林可霉素工藝生產發酵工藝后，林可霉素發酵四級放罐效價高達7 505 U/mL，比原始工藝四級放罐效價提高了16%。在林可霉素現有工業發酵工藝的基礎上進行工藝優化，不但使二級種子無菌檢驗批次增加，降低了種子液帶菌的風險，而且較高的種子菌體濃度，縮短了種子在發酵罐中的適應期，促進了后續發酵效價的提高，給工廠帶來了一定的經濟效益。

[1]SPIZEK J,REZANKA T.Lincomycin,clindamycin and their applications[J].Appl Microbiol Biot,2004,64:455-464.

[2]LI X,ZHANG J,TAN Y L.Effects of flow field on the metabolic characteristics ofStreptomyces lincolnensisin the industrial fermentation of lincomycin[J].J Biosci Bioeng,2013,115:27-31.

[3]李 華，張 立，王 鑫.林可霉素發酵工藝優化降低B組分[J].科技信息，2016，45（8）：63-64.

[4]呂和平，龐學瑋，劉儉國.稀土元素對林可霉素生物合成的影響[J].山東化工，2016，45（18）：19-22.

[5]RAJESWARAN M.,SRIKRISHNAN T.Crystal and molecular structure and absolute configuration of lincomycin hydrochloride monohydrate[J].Carbohyd Res,2004,339:2111-2115.

[6]張海丹.林可霉素的生物合成及發酵工藝的調控[D].上海：華東理工大學，2014.

[7]張 銳，劉 虹，劉儉國，等.林可霉素發酵中后期代謝的調控[J].廣東化工，2016，43（5）：67-68.

[8]薛正蓮，朱 艷，張相美，等.響應面優化林可霉素發酵培養基[J].中國抗生素雜志，2009，34（5）：277-280.

[9]YE R F,WANG Q,ZHOU X F.Lincomycin,rational selection of high producing strain and improved fermentation by amino acids supplementation[J].Bioproc Biosyst Eng,2009,32:521-529.

[10]QIAN G,WU Y Y,YANG X Y,et al.Exploiting polymorphism in the purity enhancement of lincomycin hydrochloride[J].Chem Eng Sci,2012,77:42-46.

[11]董維平，楊淑慎，李維平，等.林可霉素菌種選育及搖瓶培養基的優化[J].河南科學，2016，34（3）：327-331.

[12]DU L,LIU R H,LI Y.An efficient intergeneric conjugation of DNA fromEscherichia colito mycelia of the lincomycin-producerStreptomyces lincolnensis[J].Int J Mol Sci,2012,13:4797-4806.

[13]鄧加聰，施瀟蕊，曾德樣，等.高產林可霉素鏈霉菌的篩選及發酵條件的優化[J].中國釀造，2015，34（11）：99-102.

[14]CHOI D,CHO K.Effect of carbon source consumption rate on lincomycin production fromStreptomyces lincolnensis[J].J Microbiol Biotechn,2004,14(3):532-539

[15]LI X B,ZHAO G R,ZHENG H.Improved industrial fermentation of lincomycin by phosphorus feeding[J].Process Biochem,2007,42(4):662-668.

[16]LEE Y R,LEE M J.CHOI Y E.Optimization of cultivation medium and fermentation parameters for lincomycin production byStreptomyces lincolnensis[J].Biotechnol Bioproc Eng,2014,19:1014-1021.

[17]喬現婷.林可霉素髙產菌株及代謝過程的調控[D].上海：華東理工大學，2011.

[18]儲 矩，李友榮.現代工業發酵調控學[M].北京：化學工業出版社，2006：59-62.

[19]胡彪群.林可霉素發酵工藝及膜分離技術的研[J].南昌：江西師范大學，2015.

[20]SPIZEK J,REZANKA T.Lincomycin,cultivation of producing strains and biosynthesis[J].Appl Microbiol Biot,2004,63(5):510-519.

[21]HAQ I,ALI S,QUADEER M A.Influence of dissolved oxygen concentration on intracellular pH for regulation ofAspergillus nigergrowth rate during citric acid fermentation in a stirred tank bioreactor[J].Int J Biol Sci,2005,1(1):34-41.

[22]鐘益清.林可霉素中試發酵工藝的優化[D].南昌：江西師范大學，2013.[23]李繼安，林惠敏，牛金剛，等.流加補料技術在林可霉素發酵中的應用[J].中國醫藥工業雜志，2012，43（9）：739-742.

[24]毛全貴，賴 坤，邢繼紅.林可霉素發酵后期的工藝改進[J].國外醫藥抗生素分冊，2014，35（6）：265-267.

[25]李 嘯，杭海峰，儲 炬，等.林可霉素生物合成過程中后期的調控研究[J].工業微生物雜志，2008，38（4）：7-13.

Optimization of fermentation process of lincomycin industrial production

XIE Ting,WU Pei*,HAN Dequan,MA Chaoan,ZHANG Zenghui,LI Shengli,ZHAO Xiaoqiang
(Topfond Pharmaceutical Co.,Ltd.,Zhumadian 463000,China)

In order to increase the fermentation potency of lincomycin industrial production,the fermentation process of lincomycin was optimized.The results showed that the optimum fermentation conditions of lincomycin were as follow:the concentrations of starch and soybean cake powder in the fermentation medium of two-stage seeds fermenter were 0.97%and 1.43%,respectively,the transplanting cell age of two-stage seeds was extended to 48 h and the volume of the base material of four-stage fermentation tank was 8 m3.Under the optimum fermentation conditions,the fermentation potency of lincomycin after four-stage fermentation was up to 7 505 U/ml,which was 16%higher than that of the original fermentation process.The fermentation process of lincomycin industrial production was optimized preliminarily,and the fermentation efficiency and yield of lincomycin were improved.

Streptomyces lincolnensis;lincomycin;industrial production;fermentation process optimization

S216.4

0254-5071（2017）09-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.013

2017-01-05

謝 婷（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向為微生物發酵工程。*

武 培（1984-），男，工程師，碩士，研究方向為微生物發酵工程。