響應面法優(yōu)化白酒糟富里酸的提取工藝

芮文君，趙 萍*，邱 悅，楊 恒，劉金濤，王 歡，張 軼

（蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

響應面法優(yōu)化白酒糟富里酸的提取工藝

芮文君，趙 萍*，邱 悅，楊 恒，劉金濤，王 歡，張 軼

（蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

根據(jù)腐殖質(zhì)的成因和白酒糟形成過程之間的相關聯(lián)系，以鮮、干白酒糟為原料提取白酒糟富里酸，分析干、鮮白酒糟中富里酸的含量變化；對比水浴提取和超聲提取條件下的富里酸得率，確定提取方法；單因素和響應面優(yōu)化法確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，鮮白酒糟中富里酸含量高于干白酒糟；超聲提取法優(yōu)于水浴提取法；富里酸的最佳提取工藝為固液比1∶8.4（g∶mL），pH值11.2，超聲時間32 min，超聲功率360 W，超聲溫度45℃，富里酸得率達6.29%。

白酒糟；富里酸；響應面；超聲輔助；提取工藝

白酒糟是酒醅發(fā)酵完成后再經(jīng)蒸餾出酒而殘留的混合固形物，因此白酒糟中有相當多未利用的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等成分，與酒醅中的營養(yǎng)成分相似，只是在數(shù)量上有差別，而且鮮白酒糟的含水量達60%左右，不僅量大而集中且營養(yǎng)物質(zhì)豐富[1-2]。目前，我國酒廠的固體白酒糟多作為燒柴、飼料或者農(nóng)肥等，而這些利用并沒有做到物盡其用，加之鮮酒糟因為含水量較高所以在利用方面會提高干燥和運輸?shù)瘸杀荆瑥亩鴮е麓罅堪拙圃惚浑S意丟棄或焚燒[3-4]。鮮白酒糟如果不及時加以處理，易發(fā)霉變質(zhì)，不僅浪費了寶貴的資源，還會污染周圍環(huán)境。另外由于釀酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生了復雜的生化變化，所以白酒糟中也產(chǎn)生了大量的新成分，如核糖核酸、嘌呤、嘧啶和其他一些次級代謝等產(chǎn)物[1-6]，對白酒糟的高值化利用提供了條件。因此，研究白酒糟中的活性成分，提高對白酒糟的綜合利用，不僅直接影響釀酒生產(chǎn)企業(yè)的發(fā)展，而且同時對我國的資源開發(fā)和環(huán)境保護也具有重要的意義。

腐殖酸中顏色最淺和分子質(zhì)量最低的組分稱為富里酸（fulvic acid，F(xiàn)A），是人類已知的最好天然電解質(zhì)，因為其功能基團比較密集、溶解性好、滲透力強，所以在某些生物活性方面高于其他組分的腐植酸[7-11]。FA的形成是由微生物的分泌物和植物性化學物質(zhì)相結(jié)合且在腐殖化（分解）過程中不斷進行結(jié)構重組而產(chǎn)生的一種分子結(jié)構及其復雜的有機物[9，12-14]。白酒醅在長時間發(fā)酵過程中，有機質(zhì)的代謝過程與腐殖質(zhì)的形成過程非常相似，白酒蒸餾后的酒糟中保留著大量的未被分解的有機質(zhì)和微生物代謝產(chǎn)物，若能夠充分合理地利用酒糟，不僅可以變廢為寶，創(chuàng)造經(jīng)濟效益和社會效益，還能節(jié)約資源保護環(huán)境。因此，研究白酒糟富里酸（distillers grains fulvic acid，DFA）可為白酒糟的深入研究和綜合利用提供了一定的理論依據(jù)和實驗基礎。

本研究直接利用白酒的釀造副產(chǎn)物白酒丟糟制備提取DFA，目的在于用更經(jīng)濟、更方便的手段提取DFA，同時為DFA的進一步研究提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒糟：甘肅金徽酒業(yè)集團提供，水分含量為63.67%的鮮白酒糟按料液比1∶2.5（g∶mL）的比例打成勻漿密封冷凍待用；干白酒糟：鮮白酒糟風干后粉碎過40目篩密封，置于4℃待用。

鹽酸、硫酸：天津博逸化工股份有限公司；氫氧化鈉、焦磷酸鈉、硫酸亞鐵銨：天津市光復科技發(fā)展有限公司；重鉻酸鉀、鄰菲羅啉指示劑：煙臺市雙雙化工有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JJ-2組織勻漿機：常州萬豐儀器制造有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器：上海精密儀器儀表有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TDL-5-4離心機：上海安亭科學儀器廠；PHB-5型便攜式pH計：中國杭州雷磁分析儀器廠；LGJ-10型冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒糟中DFA含量及得率的測定

DFA的測定采用容量滴定法，參考GB18877—2009《有機-無機復混肥料》中有機質(zhì)含量的測定方法及相關文獻中FA的測定方法[15-19]，按下列公式計算樣品中DFA含量：

式中：0.003為四分之一碳的摩爾質(zhì)量的數(shù)值，g/mmol；V0為滴定空白所消耗的硫酸亞鐵銨標準溶液的體積，mL；V為滴定式樣所消耗的硫酸亞鐵銨標準溶液的體積，mL；C（Fe2+）為硫酸亞鐵銨標準滴定溶液的濃度，mol/L；k為DFA碳系數(shù)一般取0.5；m為試樣的質(zhì)量，g；a為試樣溶液的總體積，mL；b為測定時所取試樣的體積，mL。

DFA得率按下列公式計算：

式中：m為提取的DFA質(zhì)量，g；M為稱取的白酒糟質(zhì)量，g。

根據(jù)上述方法分別測量干白酒糟和鮮白酒糟（含水量為63.67%）中DFA含量（以絕干計，DW），3次重復[15，21]。

1.3.2 DFA提取方法的優(yōu)選

恒溫水浴提取法：取定量的鮮白酒糟勻漿于250 mL磨口錐形瓶中，加50 mL蒸餾水搖勻，加入1 mL 0.5 mol/L的焦磷酸鈉后再用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至10。充分搖勻后放入溫度為40℃水浴鍋中提取20min，以3900r/min離心15 min，取上清液再抽濾，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)濾液pH至2。冷沉12 h后以3 900 r/min離心15 min，收集上清液即為DFA提取液，旋蒸濃縮后冷凍干燥并稱質(zhì)量[19-24]，計算得率。

超聲波輔助提取法：步驟同上，將水浴提取條件變?yōu)闇囟?0℃，超聲功率240 W，提取20 min，然后與水浴提取比較得率[19-27]。

1.3.3 不同因素對DFA提取效果的影響

采用1.3.2優(yōu)選出的提取方法，選取固液比、堿溶pH、超聲功率、超聲時間、超聲溫度為影響因素，以DFA得率為評價指標，確定各單因素變量后依序?qū)嶒炦x擇最佳單因素的最佳水平為后續(xù)試驗[28-33]。

選1.3.2優(yōu)選后的方法，考察不同因素對DFA提取效果的影響[19-20，22]。

根據(jù)上述實驗先將固液比變量定為：1∶2.5、1∶5.0、1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5、1∶15.0（g∶mL）進行提取；預實驗pH 8～10組的DFA得率變化不明顯，確定固液比后，將pH變量定為8.0、9.0、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5；確定pH后，步驟同上依次按序分別確定超聲功率（240W、300W、360W、420W、480 W、540 W、600 W）、超聲時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）和超聲溫度（20 ℃、30 ℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取對DFA提取影響較大的3個因素確定Box-Behnken設計的因素和水平，以DFA得率（Y）為響應值，通過響應面分析優(yōu)化提取條件[28-33]，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 提取條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 DFA提取方法的確定

根據(jù)1.3.2的試驗結(jié)果，對比恒溫水浴提取法和超聲波輔助提取法的DFA得率優(yōu)選提取方法。其得率分別為4.16%和5.21%，表明在相同時間和相同溫度條件下，超聲波輔助提取明顯優(yōu)于水浴加熱提取。超聲波提取是利用超聲空穴破壞細胞壁從而增加溶劑穿透力，這樣能提高提取效率和縮短提取時間，以達到高效、快速提取細胞內(nèi)容物的一種普遍運用的輔助提取方法[25-27]。因此，本試驗選擇超聲波輔助法提取DFA。

2.2 不同白酒糟中DFA含量變化

表2 不同白酒糟中富里酸含量Table 2 Fulvic acid contents in different distillers grains

不同白酒糟在不同時間條件下的DFA含量結(jié)果見表2。根據(jù)表2可知，隨著時間的推移，干白酒糟中DFA含量變化不大，而鮮白酒糟中DFA含量表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，并且鮮白酒糟中的DFA含量明顯高于干白酒糟。因此本試驗采用鮮白酒糟直接提取，并密封保存以減小DFA含量的損失，既避免干燥帶來的成本問題又能提高DFA得率[19-23]。

2.3 影響DFA提取的單因素分析

2.3.1 固液比對DFA提取效果的影響

固液比對DFA得率的影響見圖1。由圖1可知，隨著溶劑量的增加，DFA的得率也逐漸增加，當固液比為1∶7.5（g∶mL）時，DFA得率達到最高，固液比繼續(xù)增加，DFA得率趨于平緩。因此，從提取效果和溶劑用量及降低濃縮負荷等方面綜合考慮，固液比定為1∶7.5（g∶mL）較為適宜。

圖1 固液比對富里酸得率的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on fulvic acid yield

2.3.2 pH值對DFA提取效果的影響

pH值對DFA得率的影響見圖2。由圖2可知，隨著堿液pH值的增加，DFA的得率先增加后減小，pH值在8.0～9.5之間時，DFA得率逐漸增加且增加較快，在10到11之間增加趨勢趨于平緩，當pH=11.0時，DFA提取率達到最高。當pH＞11.0時得率開始下降且下降趨勢較快。這可能是由于堿溶物達到飽和之后，在酸沉時析出產(chǎn)生更多沉淀，從而影響了DFA的得率。因此，從提取效果和資源節(jié)約方面考慮，選用堿液pH=11.0為最佳值。

圖2 pH值對富里酸得率的影響Fig.2 Effect of pH on fulvic acid yield

2.3.3 超聲功率對DFA提取效果的影響

超聲功率對DAF得率的影響見圖3。由圖3可知，隨著超聲功率的增加，DFA得率先增加后減小，不過整體變化幅度不大，在超聲功率為360 W時得率達到最大，之后開始下降，可能是較高的超聲功率促進了溶液中各成分的相互作用，發(fā)生聚合氧化等反應從而降低DFA得率。所以將360 W定為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對富里酸得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on fulvic acid yield

2.3.4 超聲時間對DFA提取效果的影響

超聲時間對DFA得率的影響見圖4。由圖4可知，超聲時間在10～30 min內(nèi)隨著超聲時間的增加，DFA得率增加相對較顯著，超聲時間為30 min時，DFA得率最大，當超聲時間在30～60 min內(nèi)，當DFA得率開始下降，但下降趨勢較緩慢。分析原因可能是隨著時間的延長，堿溶物發(fā)生降解、氧化或相互之間縮合等反應的幾率也相應增高，所以酸沉時會產(chǎn)生更多沉淀從而影響得率，而且過長的超聲時間也可能使白酒糟中的其他物質(zhì)溶出使DFA含更多雜質(zhì)，從而影響得率。綜合考慮提取效果和節(jié)能等因素，選取30 min為最佳超聲時間。

圖4 超聲時間對富里酸得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on fulvic acid yield

2.3.5 超聲溫度對DFA提取效果的影響

超聲溫度對DFA得率的影響見圖5。由圖5可知，超聲溫度在25～45℃之間時，隨著超聲溫度的升高DFA的得率也在增加，不過整體增加幅度相對較小，但當超聲溫度高于45℃低于55℃時，隨著溫度的升高得率開始緩慢下降，超聲溫度高于60℃時，DFA得率下降迅速。分析原因可能是較高的超聲溫度促進了溶液中各成分之間的相互作用以及分解縮合氧化等反應使得率下降，或是高溫不利于DFA的穩(wěn)定，從而影響了DFA得率。所以將45℃定為最佳超聲溫度。

圖5 超聲溫度對富里酸得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on fulvic acid yield

2.4 影響DFA提取因素的響應面分析

2.4.1 不同因素對DFA提取效果的影響

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對DFA提取效果的影響，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選擇固液比、超聲時間、堿溶pH進行3因素3水平的響應面分析法，確定DFA的最佳提取條件，響應面試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 提取條件優(yōu)化響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for extraction conditions optimization

將所得試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得DFA得率對固液比（A）、pH（B）、超聲時間（C）的二次多項回歸方程為：

Y=6.36+0.55A+0.17B+0.11C+0.08AB-0.035AC-0.025BC-

0.62 A2-0.41B2-0.28C2

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由表4可知，模型F值為70.33，P＜0.000 1，表明響應面回歸模型達到了極顯著水平（P＜0.01）。失擬項P=6.34＞0.05，表示失擬不顯著，模型的確定系數(shù)R2=0.989 1，說明該模型能解釋98.91%響應值的變化，因而該模型擬合程度比較好，可以用此模型對DFA提取進行分析和預測。由回歸模型和方差分析可知，方程一次項A、B、方程二次項A2、B2、C2對DFA得率的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；方程一次項C對DFA得率的影響達到顯著水平（P＜0.05），交互項AB、AC、BC對DFA得率的影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可知，各個因素對DFA得率影響的大小順序為[28-30]：固液比（A）＞pH值（B）＞超聲時間（C）。

2.4.2 響應面直觀分析

響應面分析結(jié)果見圖6，圖上能比較直觀和形象的看出最佳因素參數(shù)及各因素之間的交互作用[28，32]。3個響應面圖均為開口向下的凹形曲面，相應的等高線圖呈明顯的橢圓形，說明兩因素之間交互作用顯著（P＜0.01）[29-33]；且響應面圖開口向下，說明響應值（DFA得率）在其范圍內(nèi)存在最大值。

根據(jù)回歸方程求得固液比、pH、超聲時間分別取1∶8.38（g∶mL）、11.17、32.42 min時，可得理論上的最大DFA得率為6.51%。結(jié)合實際操作條件，修正固液比為1∶8.4（g∶mL）、pH值為11.2、超聲時間為32 min，3次重復得DFA實際得率為6.29%。由此可見，實際與理論值的相對誤差為0.03%，真實值與回歸方程的預測值偏差表明響應面優(yōu)化對DFA進行提取的研究是合理可行的。

圖6 固液比、pH和超聲時間交互作用對富里酸得率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid and liquid ratio,pH and ultrasonic time on fulvic acid yield

3 結(jié)論

FA具有結(jié)構復雜易變等特點，一直以來都是研究的熱點和難點，目前研究中的FA大多來自風化煤、化學合成、生化發(fā)酵或湖、海等地的沉積泥物中[18，24]，F(xiàn)A根據(jù)其原料的不同自身特性也大不相同。本文根據(jù)腐殖質(zhì)的形成特性與白酒糟自身特點之間的某些相關聯(lián)系，選擇從白酒糟中提取DFA并研究其特性。不同狀態(tài)的白酒糟中DFA的含量差異較大，選擇用新鮮的白酒糟直接打漿提取DFA，即節(jié)省干燥成本又降低了DFA的損失。利用超聲波輔助響應面優(yōu)化提取工藝，得最佳提取工藝為固液比1∶8.4（g∶mL），pH值11.2，超聲時間32 min，超聲功率360 W，超聲溫度45℃，DFA得率達到6.29%。為DFA的深入研究提供一定的技術支持和科學依據(jù)。

[1]李 建，葉 翔.酒糟綜合利用多元化研究[J].中國釀造，2013，32（12）：121-124.

[2]XIROS C,CHRISTAKOPOULOS P.Biotechnological potential of brewers spent grain and its recent applications[J].Waste Biomass Valor,2012,3(2):213-232.

[3]易 弋，黎 婭，李偉華，等.利用白酒糟生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].飼料研究，2009，12：27-29.

[4]左上春，楊海泉，鄒 偉.白酒酒糟資源化利用研究進展[J].食品工業(yè)，2016（1）：246-249.

[5]李政一，周 定，侯文華.酒糟資源化研究[J].環(huán)境科學學報，2000，20（9）：145-149.

[6]譚之磊，劉建輝，馬 凱，等.白酒糟綜合利用新技術[J].廣東化工，2015，42（7）：72-73.

[7]李艷紅，莊 銳，張 政，等.褐煤腐植酸的結(jié)構、組成及性質(zhì)的研究進展[J].化工進展，2015，34（8）：3147-3157.

[8]牛育華，李仲謹，郝明德，等.腐殖酸的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（11）：4638-4639.

[9]曾憲成.談談腐植酸[J].腐植酸，2001（4）：6.

[10]周霞萍，黃 琛.黃腐酸分子結(jié)構比較研究的新思考[J].腐植酸，2005（4）：17-20.

[11]鄒德乙.腐植酸的概念與腐植酸分類問題的探討[J].腐植酸，2011（4）：44-48.

[12]周少麗.黃腐酸研究進展[J].廣州化工，2015，43（8）：41-42，45.

[13]KLUCAKOVA M,PEKARˇM.Study of structure and properties of humic and fulvic acids.III.study of complexation of Cu2+ions with humic acid in sols[J].J Polym Mat,2003,20(2):145-153.

[14]BUFFLE J,GRETER F L,HAERDI W.Measurement of complexation properties of humic and fulvic acids in natural waters with lead and copper ion-selective electrodes[J].Anal Chem,1977,49(2):216-222.

[15]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18877—2009有機-無機復混肥料[S].北京：中國標準出版社，2013.

[16]丁為民，秦 梅，吳寶華.生化黃腐酸定量分析方法研究[J].化學工程，2003，3（6）：58-59.

[17]楊獻紅，喬桂芳，段健康.容量滴定法測定黃腐酸含量[J].河南化工，2006，23（8）：42-43.

[18]林翠蘭，曾思堅，蔡蟬鳳，等.肥料中腐植酸測定的研究[J].腐植酸，2004（1）：13-15.

[19]李小為，金俊艷.從泥碳中提取黃腐酸的探討[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2011（4）：921-923.

[20]焦元剛，朱 紅，鄒 靜，等.風化煤中黃腐酸的提取研究[J].化工時刊，2007，21（1）：30-32.

[21]高麗娟，王世強，趙雪飛，等.寧夏石嘴山褐煤腐植酸的提取工藝[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（22）：5168-5170.

[22]鄒 靜，王芳輝，朱 紅，等.風化煤中腐植酸的提取研究[J].化工時刊，2006，20（6）：10-12.

[23]楊天友，劉金濤，李剛鳳.超聲波輔助提取德江天麻多糖工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2015，34（12）：117-121.

[24]蘇 芳，顧明廣，馮獻起.超聲波輔助法提取葡萄籽中原花青素工藝的研究[J].中國釀造，2015，34（12）：113-116.

[25]陳 濤，桂 青，郭俊陸，等.傳統(tǒng)工藝山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中常規(guī)成分的變化分析[J].中國釀造，2017，36（1）：39-43.

[26]侯學敏，李林霞，張直峰，等.響應面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學，2013，34（6）：124-128.

[27]高辰哲，姜 帆，王艷菲，等.響應面法優(yōu)化紅樹莓酒發(fā)酵工藝[J].中國釀造，2016，35（12）：108-112.

[28]王海燕，李 睿，曾 秀，等.響應面優(yōu)化超聲波提取桑葉槲皮素工藝[J].食品科學，2014，35（22）：56-62.

[29]龐庭才，鐘秋平，胡上英，等.響應面分析法優(yōu)化堿蓬黃酮提取工藝[J].中國釀造，2016，35（11）：140-144.

[30]賀 寅，王 強，鐘 葵.響應面優(yōu)化酶法提取龍眼多糖工藝[J].食品科學，2011，32（2）：79-83.

[31]彭曉霞，路莎莎.響應面優(yōu)化法在中藥研究中的應用和發(fā)展[J].中國實驗方劑學雜志，2011（19）：293-299.

Optimization of extraction technology of fulvic acid in distillers grains by response surface method

RUI Wenjun,ZHAO Ping*,QIU Yue,YANG Heng,LIU Jintao,WANG Huan,ZHANG Yi
(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

According to the correlation between the formation of humus and distillers grains,using distillers grains as raw materials,fulvic acid was extracted from distillers grains.Compared with the content of the fulvic acid in dried and fresh distillers grains,the fulvic acid yield by water bath extraction and ultrasonic extraction methods were compared,and then the extraction method was determined.The fulvic acid extraction conditions were determined by single factor experiments and response surface experiments.Results showed that the fulvic acid contents in the fresh distillers grains was higher than that of the dry distillers grains,and ultrasonic assisted wethod was better than water bath extraction;the optimum extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶8.4(g∶ml),pH11.2,ultrasonic time 32 min,power 360 W,temperature 45 ℃,and the yield of fulvic acid was 6.29%.

distillers grains;fulvic acid;response surface method;ultrasonic assisted;extraction process

TS209

0254-5071（2017）09-0082-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.018

2017-03-31

甘肅省高等學校科研項目（2014A-030）

芮文君（1989-），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與副產(chǎn)物綜合利用。

*通訊作者：趙 萍（1964-），女，教授，碩士，研究方向為食品科學、農(nóng)產(chǎn)品加工與副產(chǎn)物綜合利用方面。