釀酒廢水產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

彭翠珍，宗緒巖，4，徐 勇，沈小娟，3，彭遠(yuǎn)松，3，雷翔云，3，張宿義，3，4*，李 建，陳 飛

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000；4.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實驗室，四川 自貢 643000；5.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400030）

釀酒廢水產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

彭翠珍1，宗緒巖1，4，徐 勇2，沈小娟2，3，彭遠(yuǎn)松2，3，雷翔云2，3，張宿義2，3，4*，李 建1，陳 飛5

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000；4.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實驗室，四川 自貢 643000；5.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400030）

該研究采用平板劃線法、液體發(fā)酵篩選獲得產(chǎn)絮凝劑菌株，命名為Y1，采用形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA測序及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析進(jìn)行鑒定；并在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法優(yōu)化菌株Y1的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，菌株Y1為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），最佳發(fā)酵條件為初始pH7.4，轉(zhuǎn)速147 r/min，溫度35℃，接種量8%。在最佳發(fā)酵條件下，絮凝率為81.6%。

釀酒廢水；菌種篩選；微生物絮凝劑；發(fā)酵條件；優(yōu)化

微生物絮凝劑（microbial flocculants，MBF）是由糖類、蛋白質(zhì)、纖維素和核酸組成的高分子化合物，利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)細(xì)菌、真菌、霉菌等微生物發(fā)酵、提純獲得[1]。傳統(tǒng)無機(jī)化學(xué)絮凝劑及有機(jī)高分子合成絮凝劑難降解、絮凝活性不佳、易造成二次污染，對人體有害；MBF可降解性高、應(yīng)用范圍廣、對環(huán)境無二次污染，與化學(xué)絮凝劑相比，具有一定的明顯優(yōu)勢[2-3]。微生物發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑因穩(wěn)定性不強(qiáng)、適應(yīng)性差、發(fā)酵周期較長、成本高等缺點(diǎn)，工業(yè)化應(yīng)用較難[4-6]。

白酒廢水屬于高濃度有機(jī)廢水，富含香味物質(zhì)、淀粉、還原糖、有機(jī)酸、酯類、醇類等，有機(jī)物的降解是廢水處理的關(guān)鍵[7-8]。目前，釀酒廢水采用過濾、重力沉降、氣浮、酸堿中和、微生物降解等方法進(jìn)行處理，其中使用的化學(xué)絮凝劑有毒，并且易造成二次污染，微生物絮凝劑無毒、無污染，是其理想的替代產(chǎn)品[9-10]。該研究以篩選利用釀酒廢水發(fā)酵產(chǎn)微生物絮凝劑的菌種、探索廢水資源化利用途徑為目的，采用平板劃線和液體發(fā)酵從活性污泥中篩選到產(chǎn)絮凝劑的菌株；利用單因素和響應(yīng)面法對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌種利用廢水培養(yǎng)基的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性污泥及釀酒廢水采自某名優(yōu)酒廠公司污水處理站，使用前調(diào)節(jié)pH 7.0。

氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、尿素、七水硫酸鎂、碘化鉀、碘：成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、酵母膏、蛋白胨：北京奧博星生物科技有限公司；高嶺土：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

種子液培養(yǎng)基：氯化鈉0.5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏3g/L；

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母膏0.5 g/L、氯化鈉0.5g/L、磷酸氫二鉀5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸銨0.2g/L、尿素0.5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L，pH 7.5；

廢水發(fā)酵培養(yǎng)基：廢水化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）10 000 mg/L 、氨氮78 mg/L、pH 4.79。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600PC型紫外分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SW-CJ-2D型雙人無菌工作臺：蘇州凈化有限公司；YXQ-LS100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋、BSD-YX320型智能精密搖床：上海博訊實業(yè)有限公司；DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PS-3600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DT1002A型電子天平：成都晟杰科技有限公司；ZHP-160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海鴻都科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的分離和篩選

稱取10g樣品溶于90mL無菌水，180r/min振蕩20min。稀釋10-5、10-6、10-7后，取1 mL菌液涂布于瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。采用平板劃線法純化菌株，重復(fù)實驗直至獲得純菌落。接斜面，4℃保存。

初篩：挑斜面菌種接入裝有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h作種子液。10 mL種子液接種到90 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min條件下發(fā)酵72 h。測定發(fā)酵液的絮凝率，選出絮凝率＞60%的菌株。

復(fù)篩：10 mL種子液接種到90 mL釀酒廢水中，30℃、150 r/min條件下發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵液的絮凝率，選擇絮凝率最大的菌株。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)鑒定

觀察菌株的瓊脂平板菌落形態(tài)，并采用革蘭氏染色法[11]，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

（2）分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：按SK8255（細(xì)菌）試劑盒操作提取待測菌株的全基因組DNA并以其為模板。

16SrDNA序列擴(kuò)增及測序：以細(xì)菌通用引物F27/R1492進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增16SrDNA。PCR反應(yīng)體系：模板DNA0.5μL，10×Buffer2.5μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1μL，Tap酶0.2μL，引物各0.5μL，加雙蒸水至25μL。PCR循環(huán)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃退火45 s，55℃變性45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃修復(fù)10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工測序。測序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進(jìn)行Blast同源序列比對分析，MEGA5.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌株種屬關(guān)系[12]。

1.3.3 分析檢測

絮凝率測定方法[13]：稱取4 g高嶺土溶于1 L蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杓纯伞?50 mL錐形瓶中加94 mL的高嶺土懸液，4 mL 1%CaCl2溶液和2 mL發(fā)酵液，180 r/min振蕩10 min，靜置10 min后吸取上清液，測定OD550nm值，以蒸餾水作空白對照，重復(fù)3次。絮凝率計算公式如下：

式中：A為對照組上清液的OD550nm的值；B為實驗組上清液的OD550nm值。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

生長曲線及最佳發(fā)酵時間：在上述最佳條件下，每隔一段時間（24h內(nèi)間隔3h，60h內(nèi)間隔6h，以后間隔12h）取樣，按1.3.3方法測絮凝率，以液體培養(yǎng)基作空白測定OD600nm值，確定最佳發(fā)酵時間。

按初篩方法發(fā)酵，考察培養(yǎng)基不同初始pH（5、6、7、8、9）、培養(yǎng)溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃）、轉(zhuǎn)速（140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min、180 r/min）、接種量（6%、8%、10%、12%、14%）對發(fā)酵液絮凝率的影響，絮凝率測定方法按照1.3.3進(jìn)行。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)為中心點(diǎn)，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗原理[14]，運(yùn)用Design Expert 8.0軟件以初始pH（X1）、轉(zhuǎn)速（X2）、溫度（X3）、接種量（X4）為評價因素，以絮凝率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選結(jié)果

采用平板劃線法，從活性污泥中分離獲得21株純菌株，經(jīng)初篩和復(fù)篩，篩選出5株利用釀酒廢水產(chǎn)絮凝劑活性較強(qiáng)的菌株，分別命名為Y1、Y6、Y8、H5、H8。如圖 1所示，各菌株的絮凝率＞60%，Y1的絮凝活性最佳為65.8%，選擇該菌株為后期實驗研究對象。

圖1 不同菌株的絮凝率Fig.1 Flocculation rate of different strains

2.1.1 菌株Y1形態(tài)特征

由圖2A可知，菌株Y1的菌落接近圓形，直徑3～6 mm，凸起，邊緣淺裂，表面呈蠟質(zhì)狀、乳白色。由圖2B可知，菌株的革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀。

圖2 菌株Y1的菌落形態(tài)(A)與細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.2 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain Y1

2.1.2 菌株Y1的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)復(fù)篩結(jié)果，選菌株Y1進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，提取菌株Y1的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度約為1 437 bp。

圖3 菌株Y1 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA gene sequence of strain Y1

將該序列提交GenBank，登錄號為U73Y32KV016。將已測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性對比，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4所示。由圖4可知，該序列與數(shù)據(jù)庫中的Bacillus屬的菌株有99%～100%高度相似序列，鑒定菌株Y1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 菌株Y1的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y1

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵時間的確定

菌株Y1的pH、菌體生長量和絮凝率隨發(fā)酵時間變化情況如圖5所示。由圖5可知，菌株Y1的延滯期為6 h，6～24 h內(nèi)為對數(shù)生長期，24 h進(jìn)入穩(wěn)定期。絮凝率變化不同于生長曲線，24 h內(nèi)，絮凝率變化緩慢，24 h后變化速度加快，直至54 h，絮凝率最大為79.3%，此時菌體進(jìn)入衰亡期，之后絮凝率有所降低。整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH呈現(xiàn)下降趨勢，發(fā)酵完成時發(fā)酵液呈微酸性。根據(jù)實驗結(jié)果，確定菌株Y1的最佳發(fā)酵時間54 h。

圖5 菌株Y1生長量、絮凝率、pH隨培養(yǎng)時間變化曲線Fig.5 Change curves of the growth,flocculation rate and pH of strain Y1 with time

2.2.2 初始pH對發(fā)酵液絮凝率的影響

pH值是影響微生物生長和代謝的重要因素之一，pH偏高或偏低時會影響微生物的生長和代謝產(chǎn)物的形成[15]。由圖6可知，菌株Y1在初始pH值為5～7范圍內(nèi)，絮凝率隨pH值的增加而增加；在pH值為7時，絮凝率最大為69.9%；當(dāng)pH＞7，絮凝率隨初始pH值的增加而下降。因此，最佳的培養(yǎng)基初始pH為7。

圖6 培養(yǎng)基初始pH對絮凝率的影響Fig.6 Effect of medium initial pH on flocculation rate

2.2.3 溫度對發(fā)酵液絮凝率的影響

圖7 溫度對絮凝率的影響Fig.7 Effect of temperature on flocculation rate

由圖7可知，溫度為26～36℃時，絮凝率均＞60%；溫度為36℃時，絮凝率最大，為78.4%；當(dāng)溫度＞36℃時，絮凝率有下降。單因素試驗發(fā)現(xiàn)34℃發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的絮凝率和36℃條件下幾近相同，因此，最佳溫度選擇35℃[16]。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液絮凝率的影響

圖8 轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響Fig.8 Effect of rotate speed on flocculation rate

搖床轉(zhuǎn)速影響發(fā)酵過程的溶氧，從而需要菌中的生長與代謝[17]。由圖8可知，轉(zhuǎn)速為140～180 r/min時，絮凝率先增加后降低；當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時，絮凝率最大，為80.7%。因此，選擇最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.2.5 接種量對發(fā)酵液絮凝率的影響

圖9 接種量對絮凝率的影響Fig.9 Effect of inoculum on flocculation rate

由圖9可知，接種量在4%～8%內(nèi)，絮凝率呈上升趨勢，按8%接種，最大絮凝率為79.6%，當(dāng)接種量＞10%，絮凝率有所降低。控制接種量，有益于微生物的生長，能夠提高絮凝劑產(chǎn)量和絮凝活性[18]，因此，選擇最佳接種量為8%。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件，以絮凝率（Y）為響應(yīng)值，對初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度及接種量這幾個因素進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

續(xù)表

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

應(yīng)用回歸分析對方程和方程的各因子進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，以絮凝率為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測P為0.000 1，表明該二次方程模型及顯著，模型的決定系數(shù)R2=0.898 0；模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.795 9，表明回歸方程和實際試驗擬合較好，實驗誤差小，證明用響應(yīng)面法優(yōu)化絮凝率發(fā)酵條件可行。各因素對絮凝率的影響次序依次為：pH＞接種量＞轉(zhuǎn)速＞溫度。回歸擬合方程為：

Design Expert軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖10。等高線圖直觀反應(yīng)2個變量間的交互作用的顯著程度，圓形表示因素之間交互作用不顯著，橢圓行表示交互作用顯著[19]。由圖10可知，pH與轉(zhuǎn)速、pH與溫度、轉(zhuǎn)速與溫度、轉(zhuǎn)速與接種量、溫度與接種量的交互作用對絮凝率的影響均顯著（P＜0.05）；pH與接種量的交互作用不顯著（P＞0.05）。軟件分析出優(yōu)化發(fā)酵條件為：初始pH7.4，轉(zhuǎn)速146.6 r/min，溫度35℃，接種量7.8%，預(yù)測最大絮凝率為79.1%。為方便實際操作，修改最佳發(fā)酵條件為初始pH7.4，轉(zhuǎn)速147 r/min，溫度35℃，接種量8%，重復(fù)3次試驗，絮凝率為81.6%，與預(yù)測值79.1%相差2.5%，說明該方程與實際情況擬合較好。

圖10 初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量交互作用對絮凝率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH，temperature,rotate speed and inoculum on flocculation rate

3 結(jié)論

從釀酒廢水處理站的活性污泥中篩選出能利用釀酒廢水發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的微生物，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。單因素和響應(yīng)面試驗表明菌株產(chǎn)絮凝劑活性最強(qiáng)的發(fā)酵條件為初始pH值7.4，溫度35℃，轉(zhuǎn)速147 r/min，接種量 8%，發(fā)酵時間54 h。最佳發(fā)酵條件下，絮凝劑的絮凝率可達(dá)到81.6%。利用釀酒廢水產(chǎn)微生物絮凝劑菌種的篩選，為利用廉價釀酒廢水培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)微生物絮凝劑的研究及應(yīng)用究奠定了理論基礎(chǔ)。

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Screening of bioflocculant-producing strains from liquor production wastewater and optimization of fermentation conditions

PENG Cuizhen1,ZONG Xuyan1,4,XU Yong2,SHEN Xiaojuan2,3,PENG Yuansong2,3,LEIXiangyun2,3,ZHANG Suyi2,3,4*,LIJian1,CHEN Fei5
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.LuzhouLaojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;3.National Engineering Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou 646000,China;4.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China;5.Biotechnology College,Chongqing University,Chongqing 400030,China)

The bioflocculant-producing strain Y1 was screened and obtained by plate streak method and liquid fermentation,and was identified by morphological observation,16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis.On the basis of single factor experiments,the fermentation conditions of strain Y1 were optimized by response surface experiments.Results showed that strain Y1 was identified asBacillus subtilis.The optimum fermentation conditionswere initialpH7.4,rotate speed 147 r/min,temperature 35℃and inoculum8%.Under the optimumfermentation conditions,the flocculation rate was 81.6%.

liquor production wastewater;strain screening;bioflocculant;fermentation conditions;optimization

TS262.3

0254-5071（2017）09-0092-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.020

2017-07-18

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目智能上甑機(jī)器人的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化（2016YFD0400501-05）；固態(tài)釀造關(guān)鍵技術(shù)研究四川省院士（專家）工作站開放基金項目（GY2014-01）；固態(tài)釀造關(guān)鍵技術(shù)研究四川省院士（專家）工作站開放基金項目（GY2016-04）

彭翠珍（1991-），女，碩士研究生，研究方向為釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用。

*通訊作者：張宿義（1971-），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用。