β-葡萄糖苷酶生產菌篩選及酶學特性

劉文龍，王興吉，盛花開，曹世源

（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

β-葡萄糖苷酶生產菌篩選及酶學特性

劉文龍，王興吉，盛花開，曹世源

（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

以黑曲霉（Aspergillus niger）AN為出發菌株，通過亞硝基胍（NTG）誘變方法獲得了一株高產β-葡萄糖苷酶的突變株AN-17。該黑曲霉突變株AN-17在搖瓶中的β-葡萄糖苷酶酶活＞291 U/mL，且傳代發酵穩定性良好。所產β-葡萄糖苷酶對葡萄糖有良好的耐受性，在葡萄糖含量18%條件下相對酶活為95%；且該酶耐酸耐熱性良好，在pH3.0～6.5條件下處理1 h或75℃保溫處理40 min后，相對酶活＞70%。

黑曲霉；β-葡萄糖苷酶；亞硝基胍誘變；耐糖；耐酸

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。其屬于纖維素酶類，能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基[1]。β-葡萄糖苷酶存在于自然界許多植物、昆蟲、真菌及細菌體內，在纖維素降解[2]、食品去苦增香[3]、果酒增香[4]、醫藥[5]、病蟲害防治[6]等方面有廣泛應用，另外在生產大豆異黃酮活性苷元[7]、天然梔子藍[8]、表面活性劑[9]等方面也有應用。

黑曲霉（Aspergillusniger）是常見的食品安全菌種，所產的β-葡萄糖苷酶在食品、醫藥等領域中有很好的發展前景。以黑曲霉AN為出發菌株，通過亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）誘變獲得黑曲霉β-葡萄糖苷酶突變株，以期能夠篩選得到高產菌株，并且獲得性能良好的β-葡萄糖苷酶，以提高其應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）AN：本公司研發中心實驗室保存。

1.1.2 培養基

初篩培養基：葡萄糖0.3%，纖維糖粉0.5%，蛋白胨0.08%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，FeSO4·7H2O 0.001%，脫氧膽酸鈉0.1%，瓊脂0.15%，冷卻后加入0.1%對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPG），pH自然。

復篩發酵培養基：葡萄糖2%，纖維糖粉1%，玉米漿1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.02%，FeSO4·7H2O0.001%，pH自然。

斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基。

1.1.3 試劑及原料

蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；亞硝基胍、對硝基苯葡萄糖苷（分析純）：美國Sigma公司。其他均為國藥集團分析純試劑。

1.2 儀器與設備

ZWY-211C恒溫搖床、ZXSD-AI270恒溫培養箱、ZHJHCI214B超凈工作臺：智城分析儀器有限公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋：致微儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；FA2004B電子天平：上海精科天美科學儀器有限公司；5810R型離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 誘變篩選方法

（1）孢子懸液的制備

取無菌生理鹽水洗下黑曲霉AN新鮮斜面上的孢子，將其轉移入盛有玻璃珠的三角瓶，在搖床上振蕩打散40min，制成菌懸液，四層擦鏡紙過濾，并進行梯度稀釋，于血球計數板計數并調整孢子濃度為106個/mL左右[10]。

（2）亞硝基胍誘變[11]

誘變劑量選擇[12]：用處理好的孢子懸浮液，分別以亞硝基胍溶液終質量濃度為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的體系對孢子菌懸液誘變處理60min，吸取處理后的孢子懸浮液涂布于PDA培養平板上，30℃培養2～3 d，計算致死率，以選擇合適的亞硝基胍處理液質量濃度。

誘變處理：根據上述方法選擇出的誘變劑量對黑曲霉孢子懸浮液進行亞硝基胍誘變處理，處理后的孢子懸液涂初篩平板。

（3）初篩

初篩培養基冷卻至60℃后，加入0.1%p-NPG，將誘變處理的孢子懸液涂布在初篩培養平板上，30℃培養2～4 d，p-NPG被酶解后會產生對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP），噴灑1 mol/L的Na2CO3后顯淡黃色，挑選其中黃色較深圈較大的菌落進一步篩選[13]。

（4）復篩

初篩挑選的菌落接種于裝有30 mL復篩液體發酵培養基的三角瓶中。30℃、200 r/min培養2～4 d，測β-葡萄糖苷酶酶活。

1.3.2 遺傳穩定性[14]

對突變株進行連續傳代發酵，30℃、200 r/min培養傳代8次，測定每一代的β-葡萄糖苷酶酶活，每代設置至少三個平行樣，判斷其遺傳穩定性。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性、熱穩定性、pH穩定性

以發酵液上清液為樣品，分別在反應體系中添加含量0～20%的葡萄糖，測定β-葡萄糖苷酶活力。

以發酵液上清液為樣品，在pH4.8緩沖液條件下，樣品分別在60～85℃條件下（梯度為5℃）保溫處理70 min，每10min取樣測定剩余β-葡萄糖苷酶酶活，以不作處理的β-葡萄糖苷酶酶活為100%。

以發酵液上清液為樣品，在50℃條件下，分別在pH 2.0～9.0的緩沖液中處理1 h，然后測定β-葡萄糖苷酶活力，以不作處理的樣品酶活為100%。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶酶活測定[15]

酶活定義：每分鐘釋放出1 μmol p-NP所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

測定方法：發酵液3 000 r/min離心10 min，得上清液為粗酶液，準確吸取0.1 mL粗酶液，加入0.9 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.8），50℃恒溫水浴鍋預熱5 min，加入1 mL預熱的5 mmol/L的p-NPG，秒表計時50℃反應10 min，立即加入1 mL 1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應。在波長420 nm處測定吸光度值。

2 結果與分析

2.1 誘變方法的確定

表1 不同NTG誘變劑量對菌株的致死率Table 1 Lethality rate of strains induced by different NTG doses

從表1可看出，隨著亞硝基胍誘變劑量的增加，黑曲霉存活率下降，誘變劑量0.8 mg/mL時，致死率達到97.8%，劑量達到1.0 mg/mL時，致死率達到100%。通常致死率為90%～99%時，正向突變的突變株較多。因此選擇0.8mg/mL亞硝基胍誘變劑量。

2.2 菌株篩選

根據初篩結果，選取14株黃色較深圈較大的菌落，進行發酵搖瓶復篩，經過3批搖瓶發酵試驗，篩選產酶較高的菌株，結果見表2。

表2 NTG誘變復篩的結果Table 2 Secondary screening results of NTG mutagenesis

由表2可知，突變株AN-17的β-葡萄糖苷酶酶活最高，在復篩培養基中可達到291.2 U/mL。

2.3 遺傳穩定性

選取產β-葡萄糖苷酶酶活最高的菌株AN-17，傳代8次，進行穩定性研究，結果見表3。

表3 突變株AN-17發酵穩定性Table 3 Fermentation stability of mutant strain AN-17

由表3可知，連續傳8代，酶活并沒有降低，因此確定突變株AN-17具有良好的遺傳穩定性，可以用于進一步優化中。

2.4 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性、熱穩定性、pH穩定性

2.4.1 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性

由圖1可知，在葡萄糖含量＜16%時對酶活有增強作用，可能是葡萄糖使β-葡萄糖苷酶作用位點發生改變[16]，使酶活增強，在葡萄糖含量為18%時，相對酶活為95%，說明突變株AN-17所產β-葡萄糖苷酶具有較高的葡萄糖耐受性。

圖1 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性曲線Fig.1 Glucose tolerance curve of β-glucosidase

2.4.2 β-葡萄糖苷酶的熱穩定性

圖2 β-葡萄糖苷酶的熱穩定性曲線Fig.2 Thermal stability curves of β-glucosidase

由圖2可知，60℃條件下其酶活基本沒有降低，65℃稍有下降，75℃處理40min時，該酶相對酶活仍為70%以上，85℃處理20 min相對酶活仍有53%左右，說明該β-葡萄糖苷酶具有較好的熱穩定性。

2.4.3 β-葡萄糖苷酶的pH穩定性

圖3 β-葡萄糖苷酶的pH穩定性Fig.3 pH stability of β-glucosidase

由圖3可知，在pH 3.0～6.5條件下處理1 h相對酶活仍保留70%以上，具有較好的耐酸性，但是在pH＜3.0或pH＞7.0的條件下，相對酶活較低。

3 結論

本研究通過NTG誘變方法獲得了一株高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉突變株AN-17，并對所產β-葡萄糖苷酶的性質進行了研究。結果表明，該黑曲霉突變株AN-17在搖瓶發酵中的β-葡萄糖苷酶酶活在291 U/mL以上，且連續傳8代，酶活并沒有降低，遺傳穩定性良好。該突變株所產β-葡萄糖苷酶對葡萄糖有良好的耐受性，在葡萄糖含量18%條件下，相對酶活為95%；該酶耐酸耐熱性良好，在pH3.0～6.5條件下處理1h或75℃保溫處理40min后，相對酶活＞70%。鑒于該黑曲霉突變株AN-17及所產β-葡萄糖苷酶的良好特性，可進一步進行優化，并用于生產放大。

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Screening of β-glucosidase-producing strain and the enzymatic characteristic

LIU Wenlong,WANG Xingji,SHENG Huakai,CAO Shiyuan
(Shandong Long Kete Enzyme Co.,Ltd.,Linyi 276400,China)

UsingAspergillus nigerAN as original strain,mutant strain AN-17 with high yield β-glucosidase was obtained by nitrosoguanidine(NTG)mutagenesis.The β-glucosidase activity ofA.nigerAN-17 in shake flask was above 291 U/ml,and its generation fermentation stability was good.The β-glucosidase had good tolerance to glucose,the relative activity retained 95%in 18%glucose concentration.The β-glucosidase had good acid and heat resistance;the relative activity remained above 70%under the treatment condition of pH 3.0-6.5 for 1 h or 75℃for 40 min.

Aspergillus niger;β-glucosidase;nitroso-guanidine mutagenesis;glucose tolerance;acid tolerance

TQ925

0254-5071（2017）09-0120-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.026

2017-07-06

山東省技術創新項目（201520515022）

劉文龍（1982-），男，工程師，碩士，研究方向為酶制劑生產與開發。