仔豬腹瀉大腸桿菌菌種保存的研究

王曉燕 張建華 劉玉英 尉玉杰 王俊超 董煥聲*

仔豬腹瀉大腸桿菌菌種保存的研究

王曉燕①①張建華①劉玉英①尉玉杰①王俊超①董煥聲*①

（①青島農業大學動物科技學院 山東 青島 2661091 ①山東省萊陽市畜牧獸醫局）

本文研究了4株仔豬腹瀉大腸桿菌菌株不同代次培養的菌液，制成甘油菌后，保存在-20 6℃個月，分析細菌的菌落形態、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國獸藥典》規定標準；4批凍干保存的菌種，經過36個月的保存后，分析細菌的菌落形態、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國獸藥典》規定標準。本文為大腸桿菌病的致病機理及疾病的潛伏期提供了理論依據。

仔豬 大腸桿菌 保存

仔豬大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的一種急性高度致死性傳染病。本病最常發生于初生7日齡以內的哺乳仔豬，因哺乳仔豬下痢，機體迅速脫水，導致全身衰弱而死亡，給養豬業造成嚴重經濟損失。由于仔豬生長期和病原菌血清型的差異，此病可分仔豬黃痢及仔豬白痢兩種，豬場傳染上該病很難根除。本文針對已經分離得到的大腸桿菌菌株進行保存期的試驗，觀察大腸桿菌分離凍存后的活性及生化特性。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）甘油菌：C835491、C835492、

C835493、C8354944個批次；C836441、C836442、

C836443、C8364444個批次；C839181、C839182、

C839183、C8391844個批次。凍干菌：C835491、

C835492、C835493、C8354944個批次；C836441、

C836442、C836443、C8364444個批次；C839181、

C839182、C839183、C8391844個批次。（2）試驗動物：小白鼠、仔豬。（3）發酵管：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、靛基質、枸櫞酸7種，購于杭州天和微生物制劑有限公司。

1.2 方法 試驗菌液分別抽樣，加入20%的甘油，分裝若干小瓶，2ml/瓶，-20℃冰箱凍結，保存1、3、6、12個月。凍干菌種-20℃冰箱凍結，保存1、3、6、12、24、36個月。定期將被試驗的菌種取出檢測。取出的菌種檢測方法：將菌種劃線接種到Minca培養基上，37℃培養20h，觀察菌落特征，挑單菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體的形態。將生長好的單一菌落無污染的挑到7種發酵管中

37℃培養12h，完成吲哚試驗；M.R.試驗；VP試驗試驗；H2S試驗。血清學特性檢測：用相對應的因子血清和培養的細菌作玻板凝集試驗，觀察玻板凝集試驗的結果[1-2]。毒力測定：將3種血清型致病性大腸桿菌應用營養肉湯繁殖12h，進行細菌計數，再用無菌生理鹽水進行稀釋，以麥氏比濁法進行細菌計數，調節濃度至約3×106cfu/ml，采用30日齡ICR小鼠(體重約26g)隨機分成2組，以灌胃的方法對實驗組動物進行接種，0.2ml/鼠，對照組注射滅菌生理鹽水0.2ml/鼠，實驗組小鼠均于24h開始出現精神委靡，飲、食欲下降，打堆，大部分小鼠尿色變深[3]；死亡多發生于接種后36～72h。對照組未見異常。對死亡小鼠進行剖檢發現，所有死亡小鼠的腹腔內均有漿液性滲出；脾臟壞死；肝臟邊緣壞死，肺臟無明顯病變；腸道充滿黃色液體，部分小鼠的腸系膜出現水腫[3-4]。死亡率為87%。從各組死亡小鼠的十二指腸采樣接種麥康凱培養基，均能分離到大腸桿菌。

2 試驗結果與分析

2.1 甘油保存菌種 在-20℃冰箱保存1、3、6、12個月的大腸桿菌甘油菌，經過再次培養，完全符合大腸桿菌的菌落形態、菌落特征，菌落光滑圓整，菌種生化特性鑒定如表1所示。

表1 保存1～12個月再培養的菌種生化特性

用相對應的因子血清，做玻板凝集試驗，結果：各保存期再次培養的菌種，均能凝集相對應的因子血清，完全符合大腸桿菌的血清學特性。毒力檢測結果：試驗組小鼠均于24h開始出現精神委靡，飲、食欲下降，打堆，大部分小鼠尿色變深；死亡多發生于接種后36～72h。從各組死亡小鼠的十二指腸采樣接種麥康凱培養基，均能分離到大腸桿菌。免疫原性結果：按本規程制成疫苗，達到成品的質量標準。

2.2 凍干菌種 在-20℃冰箱保存1、3、6、12、24、36個月的凍干菌種，經過再次培養，完全符合大腸桿菌的菌落形態、菌落特征，菌落光滑圓整，菌種生化特性鑒定如表2所示。

表2 保存1～36個月再培養的菌種生化特性

用相對應的因子血清，做玻板凝集試驗，結果：各保存期再次培養的菌種，均能凝集相對應的因子血清，完全符合大腸桿菌的血清學特性。

3 結論

仔豬腹瀉大腸桿菌3個菌株的4個不同代次培養的菌液制備的4批甘油菌在-20℃保存6個月，細菌的菌落形態、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國獸用生物制品規程》規定標準；4批凍干保存的菌種，在-20℃冰箱中保存，經過36個月，細菌的菌落形態、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國獸用生物制品規程》規定標準。

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1007-1733(2017)10-0006-02

2017–06–09）