白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞NLRP3炎癥小體的作用研究＊

沈佳雯，樊丹平，邱雪梅，呂愛平，何小鵑，耿 耘＊＊

（1.西南交通大學生命科學與工程學院成都610031；2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所北京 100700；3.香港浸會大學中醫藥學院 香港 999077）

白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞NLRP3炎癥小體的作用研究＊

沈佳雯1，樊丹平2，邱雪梅1，呂愛平3，何小鵑2，耿 耘1＊＊

（1.西南交通大學生命科學與工程學院成都610031；2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所北京 100700；3.香港浸會大學中醫藥學院 香港 999077）

目的：觀察白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞NOD樣受體-3（NLRP3）炎癥小體的影響。方法：用佛波酯（PMA）（10 ng·mL-1）刺激U937細胞48 h，誘導其成為巨噬細胞，觀察不同劑量白術黃芪湯乙酸乙酯提取物（0，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg·mL-1）對細胞活力的作用，并選擇合適的濃度。采用實時熒光定量（RT-PCR）和免疫印跡法（Western blot）測定細胞中NLRP3，半胱天冬酶-1（caspase-1）的含量，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞上清液中白細胞介素（IL）-1β的含量。結果：細胞計數試劑盒（CCK-8）實驗表明，當藥物濃度低于25 μg·mL-1時，對細胞活力沒有影響，當藥物濃度高于50 μg·mL-1時，對細胞活力有抑制作用（P＜0.05），選擇25 μg·mL-1濃度進行后續實驗。與空白組相比，LPS組細胞中NLRP3，caspase-1表達明顯增加（P＜0.01），細胞培養上清中的IL-1β濃度也明顯增高（P＜0.01）。白術黃芪湯乙酸乙酯提取物作用后，NLRP3，caspase-1，IL-1β表達均明顯下降（P＜0.05）。結論：白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細胞NLRP3炎癥小體有抑制作用。

炎癥小體 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物 NLRP3 caspase-1 IL-1β

潰瘍性結腸炎是以局部黏膜的潰瘍、出血、糜爛為主要表現的慢性非特異性炎性自身免疫病[1]，目前仍然缺乏有效治療藥物。研究顯示，巨噬細胞在潰瘍性結腸炎發病過程中發揮重要作用，可通過分泌IL-1β等破壞腸黏膜屏障的細胞因子從而影響炎癥的發展方向[3]。NLRP3炎癥小體是巨噬細胞中參與炎癥反應的重要組成部分，現代研究證明其參與維持了腸道內環境的穩定。一方面，腸內病原體等不良因素可以激活NLRP3炎性體，激發腸道固有免疫發揮屏障防御作用；另一方面，炎性體的激活可導致IL-1β家族炎性因子分泌過多，加重腸黏膜炎癥反應造成腸道損傷[4]。

白術黃芪湯最早出自《劉河間醫學六書·素問病機氣宜保命集·瀉痢論·卷十九》，根據原文所述，“白術黃芪湯，服前藥，痢雖已除，猶宜此藥和之。……白術一兩，黃芪七錢，甘草三錢”。近年來，已有多篇報道證實白術黃芪湯對潰瘍性結腸炎有治療作用，且有一定的抗炎作用[5,6]，我們前期研究發現：白術黃芪湯乙酸乙酯提取物能夠抑制LPS刺激的巨噬細胞中IL-1β的表達，減輕細胞炎癥反應。上述研究提示白術黃芪湯能夠抑制細胞炎癥反應作用，然而，其是否通過調節NLRP3炎癥小體抑制巨噬細胞炎性因子的釋放目前仍不清楚。本實驗以人單核巨噬細胞系U937細胞為研究對象，以NLRP3炎癥小體為切入點，采用體外培養方法，構建體外炎癥模型，探究白術黃芪湯乙酸乙酯提取物治療潰瘍性結腸炎的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

白術黃芪湯乙酸乙酯提取物由奧地利格拉茨大學Rudolf Bauer教授提供；U937細胞（購自北京協和醫院基礎醫學研究所細胞中心）；RPMI1640培養基（美國Gibcol公司，22400089）；胎牛血清（美國Gibcol公司，10099141）；雙抗（美國Gibcol公司，15070063）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國HyClone公司，SH30256.01B）；脂多糖（美國Sigma公司，L-2880）；佛波酯（PMA）（美國Sigma公司，P1585）；CCK-8檢測試劑盒（日本DOjinDO公司，CK04）；TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司，DP405-02）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 TaKaRa公司，RR047A）；SYBR?Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）（日本TaKaRa公司，RR420A）；β-actin抗體（英國abcam公司，ab8227）；NLRP3抗體（abcam，ab214185）；Caspase-1抗體（英國abcam公司，ab1872）；RIPA裂解液（強）（碧云天生物技術，P0013）；蛋白酶抑制劑PMSF（碧云天生物技術，ST506-2）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（碧云天生物技術，P0010）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術，P0012A）；人IL-1βELISA試劑盒（美國eBioscience公司，BMS224/2）。

1.2 儀器

CO2培養箱（美國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；酶標分析儀（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機（美國sigma公司,Laboratory Centrifuges 3K15）；電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠，XMTD-204）；生物安全柜（Thermo Scientific，MSC-ADVANTAGE）；渦旋震蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司，QL-902）；熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems，AB17500）；制冰機（美國Thermo公司，Forma-86CULT）；蛋白核算凝膠成像系統（昊特偉業科技有限公司，Fluor Chem FC2）；電泳儀（美國 Bio-Rad公司，A101439）；電泳槽（美國Bio-Rad公司，1658003）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

U937細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于37℃，5%CO2培養箱中靜置培養，換液方式為半保留換液，每2天傳代一次。

1.3.2 細胞活力檢測

實驗取培養至對數生長期的U937細胞，接種于96孔板中，每孔細胞數為1×105個，加入終濃度為10ng·mL-1的PMA誘導細胞貼壁，置于培養箱中培養48 h。棄上清，加入含不同濃度藥物的新鮮培養基。實驗設置7個組：0，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg·mL-1組，每組做3個復孔。培養24 h后，每孔中加入10 μL CCK-8，再培養3 h后，450 nm處檢測吸光度值。

1.3.3 給藥實驗

選擇對數生長期的U937細胞，用RPMI1640完全培養基調整細胞濃度至5×105mL-1接種于6孔板，每孔2 mL，加PMA誘導48 h使其成長為巨噬細胞后，吸棄全部上清液，用PBS沖洗兩遍，LPS組和白術黃芪湯乙酸乙酯提取物給藥組加入2 mL含LPS（1 μg·mL-1）的培養基，空白組加入2 mL RPMI1640，置于37℃5%CO2的培養箱中作用2 h后，給藥組加入合適濃度的白術黃芪湯乙酸乙酯提取物，在培養箱中繼續培養48 h后，收集各組細胞上清和細胞，以備檢測。

1.3.4 RT-PCR檢測細胞中NLRP3，caspase-1的表達

總RNA提取按照TRIzol試劑盒說明書進行。提出的RNA在測定濃度后，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中的說明書逆轉錄合成cDNA。然后以cDNA為模板配置PCR反應體系，以內參β-actin作對照。所需引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為：NLRP3-F：CATGAGTGCTGCTTCGACAT，NLRP3-R：GCTTCAGTCCCACACACAGA，caspase-1-F：GCTTTCTGCTCTTCCACACC，caspase-1-R：TCCTCCACATCACAGGAACA，βactin-F：CTGGGACGACATGGAGAAAA，β-actin-R：AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，退火60℃，10 s，共40個循環，延伸95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 °C，15 s。

1.3.5 Westernblot檢測細胞中NLRP3，caspase-1的表達

提取細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到PVDF上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST封閉。分別加入NLRP3，caspase-1，β-actin一抗，孵育過夜，洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔IgG（二抗）。暗室內ECL發光法檢測目的條帶，膠片曝光，顯影，以β-actin為內參分析結果。

1.3.6 ELISA檢測細胞上清中IL-1β的含量

將收集到的細胞上清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，每個樣品均設3個復孔。反應終止后用酶標儀測450 nm處的吸光度（A450）值。根據標準品濃度和A值做標準曲線，計算樣本A值對應的濃度值。

1.4 統計學處理

用SPSS18.0進行統計學分析，所有數據采用均數±標準（xˉ±s）表示，組間比較采用t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對U937細胞的活力作用，確定白術黃芪湯乙酸乙酯提取物的給藥濃度。如圖1所示，與0 μg·mL-1相比，當藥物濃度低于25 μg·mL-1時，對細胞活力沒有影響，當藥物濃度高于50 μg·mL-1時，對細胞活力有抑制作用（P＜0.05）。所以選擇25 μg·mL-1白術黃芪湯作為最佳藥物濃度。

2.2 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細胞NLRP3，caspase-1 mRNA表達的影響

圖2顯示，經LPS刺激后，巨噬細胞中NLRP3和caspase-1的mRNA水平顯著上調（P＜0.05）；白術黃芪湯乙酸乙酯提取物作用后，NLRP3和caspase-1的mRNA水平均顯著降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細胞NLRP3，caspase-1蛋白表達的影響

圖3顯示，與空白組相比，LPS組中NLRP3，caspase-1表達水平顯著升高（P＜0.01）；與LPS組相比，給藥組中NLRP3，caspase-1表達水平顯著降低（P＜0.01）。

2.4 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞上清中IL-1β的影響

采用ELISA法檢白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞上清中IL-1β的影響。實驗結果表明，與空白組相比（296.73±10.52），LPS組IL-1β含量較高（1277.63±19.21），差異具有統計學意義（P＜0.01），與LPS組相比，給藥組細胞上清中的IL-1β表達（693.59±27.93）顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

圖1 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對巨噬細胞活力的影響

圖2 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對細胞NLRP3，caspase-1 mRNA表達的影響

白術黃芪湯是金元醫家劉完素用于治療濕熱痢疾恢復期的方藥，由白術、黃芪、甘草三味藥按照10∶7∶3的比例組方而成。現代研究顯示，白術乙酸乙酯部位是其活性組分群，包含雙白術內酯、蒼術酮、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ等有效活性成分[7]，可以抗腫瘤[8]，增強機體免疫力[9]；黃芪乙酸乙酯部位中含有較多黃酮類物質[10]，在免疫調節，抗腫瘤方面有重要作用[11]。研究顯示，甘草乙酸乙酯部位中的總黃酮有顯著的抗炎效果[12]；白術黃芪湯原方為水煎劑，其乙酸乙酯提取物提取工藝簡便、成本低，通過深入研究，將其研制成抗炎新藥具有研究價值和應用前景，同時為了提高療效并探討白術黃芪湯抗炎作用的物質基礎，本研究選用白術黃芪湯乙酸乙酯提取物。

圖3 白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對細胞NLRP3，caspase-1蛋白表達的影響

炎癥小體通過招募半胱天冬酶-1前體（procaspase-1）并使2個相鄰的pro-caspase-1發生自身水解，產生具有酶活性的caspase-1，介導IL-1β等炎癥因子由前體形式轉變為活化形式，分泌到胞外發揮生物學功能[13]。越來越多的研究表明：NLRP3與潰瘍性結腸炎之間有著密切的關系，炎癥小體的激活可導致炎性因子分泌過多，加重腸黏膜炎癥反應，最終造成腸道損傷。相關研究證明：白術黃芪湯治療潰瘍性結腸炎作用明顯，能夠降低相關的炎性因子[14]，而NLRP3炎癥小體是炎癥調節的核心，提示白術黃芪湯有可能通過NLRP3炎癥小體治療潰瘍性結腸炎。

本研究結果提示：利用LPS刺激巨噬細胞，建立體外炎癥模型，并用白術黃芪湯乙酸乙酯提取物干預，發現藥物能夠顯著降低炎性巨噬細胞NLRP3，caspase-1的表達，同時能夠抑制細胞分泌炎癥因子IL-1β，提示白術黃芪湯乙酸乙酯提取物對LPS刺激的巨噬細胞NLRP3炎癥小體有抑制作用。由于體外實驗在準確反映體內環境方面存在一定局限，本研究只是用該實驗方法得到初步的觀察結果，還需要動物實驗進行進一步探索。該研究可作為相關動物實驗研究基礎，這也為白術黃芪湯治療潰瘍性結腸炎作用機制研究打下基礎。

致謝：感謝奧地利格拉茨大學Prof.Rudolf Bauer課題組為本課題提供相關藥品。

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Effects of Bai-Zhu Huang-Qi Decoction Extract on NLRP3 Inflammasome in Macrophages

Shen Jiawen1,Fan Danping2,Qiu Xuemei1,Lv Aiping3,He Xiaojuan2,Geng Yun1
(1.School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University,Chendu 610031,China;2.Institute of Basic Research in Clinical Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3.School of Chinese Medicine of Hong Kong Baptist University,Hong Kong 999077,China)

This study was aimed to observe the effect ofBai-Zhu Huang-Qi(BZHQ)decoction ethyl acetate extract on NOD like receptor family,pyrin domain-containing 3(NLRP3)inflammasome in macrophages.The U937 cells were pretreated with phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA,10 ng·mL-1)for 48 hours to induce macrophages.Effects on cell viability by different doses of BZHQ decoction ethyl acetate extract(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100 μg·mL-1)were observed to select the appropriate concentration.Contents of NLRP3 and caspase-1 in cells were detected by real-time PCR and western blot.The concentration of interleukin-1β(IL-1β)in cell supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The cell counting kit-8(CCK-8)assay showed that when the drug concentration was lower than 25 μg·mL-1,there was no impact on cell viability;when the drug concentration was higher than 50 μg·mL-1,there was inhibition on cell viability(P＜ 0.05).The concentration of 25 μg·mL-1was used to conduct the following experiment.Compared to the blank group,the expression of NLRP3 and caspase-1 in cells of the LPS group were significantly increased(P＜0.01).The concentration of IL-1βin cell supernatant was also significantly increased(P＜0.01).After treated with BZHQ decoction ethyl acetate extract,levels of NLRP3,caspase-1 and IL-1βwere significantly decreased(P＜0.05).It was concluded that BZHQ decoction ethyl acetate extract can inhibit the production of NLRP3 inflammasome in LPS-stimulated macrophages.

Inflammasome,Bai-Zhu Huang-Qidecoction ethyl acetate extract,NLRP3,caspase-1,IL-1β

10.11842/wst.2017.08.019

R33

A

2017-04-20

修回日期：2017-07-20

＊ 國家國際科技合作專項項目（2014DFG32700）：中醫藥對慢性疾病的預防與早期干預的合作研究，主持人：劉保延。

＊＊ 通訊作者：耿耘，研究生導師，主要研究方向：中藥作用機理工作。何小鵑，副研究員，主要研究方向：中藥免疫藥理研究。

（責任編輯：郭嫦娥，責任譯審：王 晶）