ELISA方法在獻(xiàn)血者血液檢測(cè)中的應(yīng)用及注意事項(xiàng)

邵家幼

【中圖分類號(hào)】R446.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】2095-6851（2017）10--01

血液質(zhì)量是當(dāng)前輸血管理工作中一項(xiàng)重要課題。為了保證血液質(zhì)量，確保臨床輸血安全有效，遏制經(jīng)血傳播疾病的發(fā)生，衛(wèi)生主管部門規(guī)定各采供血機(jī)構(gòu)，應(yīng)分別對(duì)獻(xiàn)血者采用ELISA法進(jìn)行HBs—Ag、抗一HCV、抗一HIV、TP等各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，并制定了各種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、操作規(guī)程和技術(shù)規(guī)范。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是目前采供血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行安全性指標(biāo)檢測(cè)主要的方法。近年來，各種自動(dòng)化檢測(cè)儀器設(shè)備在血站檢驗(yàn)科得到了普遍應(yīng)用，人員素質(zhì)及檢測(cè)試劑質(zhì)量不斷提高，檢驗(yàn)質(zhì)量得到了充分保證。但仍有一些困擾實(shí)驗(yàn)室人員的問題需要注意及解決，現(xiàn)探討如下。

1 ELISA的基本原理

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種具有高特異性和高敏感性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，幾乎所有的可溶性抗原一抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)，它的最小可測(cè)值達(dá)ng甚至pg水平。該方法的基本原理如下：（1）將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體（目前以聚苯乙烯微量滴定板最為常用）表面，并保持其免疫活性。此步驟稱為“固相載體的包被”，在商品化試劑盒中均已完成。（2）再將抗原或抗體與某種酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）連接成酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。檢測(cè)時(shí)，按相應(yīng)順序加入待檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，使其與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。以洗滌的方法洗去各步驟中過量的未結(jié)合物質(zhì)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（3）最后加入酶反應(yīng)的底物，底物即被酶催化生成有色產(chǎn)物，而有色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定量分析。此種顯色反應(yīng)可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

2 ELISA的分類

ELISA方法既可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。根據(jù)樣本中待測(cè)物質(zhì)的種類及性質(zhì)不同，可以設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。臨床檢驗(yàn)工作中用到的ELISA方法主要分為以下幾種類型：（1）用于檢測(cè)抗原的：雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法；（2）用于檢測(cè)抗體的：雙抗原夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法及捕獲包被法等。

3 ELISA檢測(cè)的操作要點(diǎn)

在ELISA操作中有以下幾個(gè)步驟較為關(guān)鍵：（1）加樣：加樣要準(zhǔn)確，試劑應(yīng)垂直滴加，不得傾斜、人為的加大試劑量。使用一次性吸頭，防止交叉污染。定期校準(zhǔn)加樣器。標(biāo)本應(yīng)加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要濺出及產(chǎn)生氣泡。（2）溫育：96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別，易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍孔與內(nèi)部孔的升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果有差異。因此，溫育過程中應(yīng)該用封板膜封閉整塊板，盡量避免邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。溫箱溫度必須嚴(yán)格控制，溫育時(shí)間也應(yīng)按說明書規(guī)定力求準(zhǔn)確。（3）洗板：冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，半自動(dòng)與全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果。洗滌時(shí)確認(rèn)洗液注滿每個(gè)板孔，但不可溢出板孔，棄液后將孔內(nèi)液體在吸水紙上拍干。為了洗滌效果更好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)。（4）顯色終止：顯色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格按說明書的規(guī)定。應(yīng)在顯色終止15min內(nèi)進(jìn)行酶標(biāo)儀讀取。

4 ELISA檢測(cè)中常見問題

4.1 ELISA測(cè)定中存在的“灰區(qū)”問題

ELISA是一種定性試驗(yàn)，必須在“陽性”與“陰性”之間有一條明確的分界線，也就是所謂的“陽性判斷值”（Cutoff），樣本的吸光度值（A）大于等于Cutoff值就判讀為陽性，否則則判讀為陰性。然而在實(shí)際工作中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)樣本的吸光度值（A）低于但接近Cutoff值的情況，即ELISA檢測(cè)中的“灰區(qū)”。對(duì)于這種情況，為輸血安全考慮，常常將這些血液報(bào)廢。在實(shí)際工作中可將“灰區(qū)”設(shè)在Cutoff值的70%，即對(duì)于樣本的吸光度值（A）在Cutoff值的70%到陽性判斷值之間的將其報(bào)廢。通過灰區(qū)的設(shè)定，血液安全能得到更好的保障。

4.2 “鉤狀效應(yīng)”（Hookeffect）問題

“鉤狀效應(yīng)”系指在一步法ELISA中，測(cè)定顯色隨著待測(cè)標(biāo)本中抗原或抗體濃度的增加而升高至一定程度后，測(cè)定吸光度即隨抗原或抗體濃度的增加而開始下降直至不顯色，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果的問題。在血液篩查中，有可能因“鉤狀效應(yīng)”的存在而出現(xiàn)假陰性的主要是HBsAg和抗HIV的檢測(cè)。目前，國內(nèi)HBsAg的檢測(cè)均為一步雙抗體夾心法，抗HIV有一些采用了雙抗原夾心法。盡管試劑生產(chǎn)廠家在固相和標(biāo)記抗體或抗原的選擇匹配上，采取了結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離或含多個(gè)可結(jié)合位點(diǎn)的方法，在很大程度上，可以避免或減輕“鉤狀效應(yīng)”，但如果某一批試劑外理不好或是特定的標(biāo)本，仍有可能出現(xiàn)由“鉤狀效應(yīng)”所致的假陰性。解決“鉤狀效應(yīng)”的最好的辦法，就是采用兩步法試劑盒，其次就是對(duì)每一批試劑盒使用前，采用能得到的最強(qiáng)陽性的標(biāo)本，進(jìn)行有關(guān)“鉤狀效應(yīng)”的質(zhì)檢。

4.3 試劑盒的質(zhì)檢、初檢和復(fù)檢試劑的選用

試劑盒從廠家到用戶手中，還會(huì)出現(xiàn)運(yùn)輸和貯存過程中對(duì)試劑盒質(zhì)量有影響的問題。因此，試劑盒在使用前必須進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢的重點(diǎn)包括試劑盒的有效期、測(cè)定下限、抗干擾能力以及對(duì)特殊標(biāo)本的檢出能力等方面。如何選擇初、復(fù)檢試劑，也是值得注意的一個(gè)問題。比如，HCV感染者血循環(huán)中存在針對(duì)HCV不同蛋白的抗體，而具體針對(duì)某種蛋白抗體是否出現(xiàn)、出現(xiàn)的時(shí)間、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短均有所差異，因此，ELISA測(cè)定時(shí)所使用的包被抗原必須全面，才能有效地檢出所存在的抗體。但在實(shí)際工作中，由不同的抗HCVELISA試劑盒生產(chǎn)廠家所使用的HCV抗原的來源、質(zhì)量及包被濃度各有差異，使測(cè)定中對(duì)同一份樣本所測(cè)定的結(jié)果有時(shí)會(huì)出現(xiàn)很大的差異，尤其是對(duì)較弱陽性的樣本或僅出現(xiàn)針對(duì)HCV單個(gè)蛋白成分的抗體的樣本。因此，在選擇初檢和復(fù)檢試劑盒時(shí)，最好選擇在測(cè)定不同HCV蛋白抗體上有互補(bǔ)性的試劑盒，從而最大程度的避免漏檢。

4.4 標(biāo)本的影響

標(biāo)本因素包括標(biāo)本溶血、被污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全等。

4.4.1 標(biāo)本溶血 血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶活性，因此以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定中，如血清中血紅蛋白濃度較高，很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的辣根過氧化物酶反應(yīng)顯色，造成假陽性。因此在采血過程中應(yīng)注意，采集血液標(biāo)本時(shí)應(yīng)讓血液自動(dòng)靠負(fù)壓注入試管以防標(biāo)本溶血。

4.4.2 標(biāo)本被污染 菌體可能含有內(nèi)源性過氧化物酶，可出現(xiàn)非特異性顯色，因此宜用新鮮標(biāo)本，如有特殊情況，應(yīng)冰箱保存或冰凍保存，并應(yīng)加蓋保存。

4.4.3 標(biāo)本的保存 標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)，可能造成污染或效價(jià)降低，可引起假陰性，因此應(yīng)盡量用新鮮標(biāo)本。冰凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融，因冰凍標(biāo)本的反復(fù)凍融產(chǎn)生的機(jī)械力對(duì)標(biāo)本中的蛋白分子有破壞作用，可引起假陰性。

4.4.4 標(biāo)本凝固不全 凝固不全的血清中有部分纖維蛋白原，影響結(jié)果。

4.5. 環(huán)境因素

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境也是保證結(jié)果可靠的因素之一，應(yīng)做好以下控制：①通風(fēng)、采光與防塵；②環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異，應(yīng)使用系統(tǒng)空調(diào)進(jìn)行控溫，并控制環(huán)境濕度在要求的范圍內(nèi)；③消除噪音與電磁干擾；④實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)采用蒸餾水（純水）。

5 小結(jié)

ELISA檢測(cè)受多方面因素的影響，檢測(cè)人員應(yīng)提高工作責(zé)任心，加強(qiáng)質(zhì)量控制意識(shí)，努力學(xué)習(xí)業(yè)務(wù)理論知識(shí)，提高專業(yè)技術(shù)水平，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，避免人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，加強(qiáng)各環(huán)節(jié)質(zhì)量管理，嚴(yán)格控制關(guān)鍵控制點(diǎn)，保證血液檢驗(yàn)分析前、分析中、分析后各階段質(zhì)量，不斷改進(jìn)提高檢驗(yàn)質(zhì)量，確保臨床輸血的安全性和有效性。endprint