固相親合載體應用于中藥復雜體系直接作用靶點研究的現狀與挑戰

曾克武+屠鵬飛

[摘要] 中藥是由多種化學成分構成的復雜體系，其發揮疾病治療作用的最大特色就在于其所含的多種活性成分通過多靶點協同作用得以實現。以往針對中藥的藥理機制研究大多關注于對單一信號通路的檢測或是對整體蛋白質組學變化的表型分析，尚無有效方法針對中藥的直接作用靶點開展研究。因此無法從靶點源頭上解析中藥的分子作用機制，難以科學詮釋其傳統功效，進而嚴重影響其臨床應用和國際化推廣。該文主要針對中藥復雜體系的直接作用靶點（群）的鑒定進行初步的方法學探討，提出了基于光敏偶聯技術的中藥化學成分固相親合載體的制備及靶點蛋白富集和鑒定策略，并在此基礎上探討了該策略的優勢和局限性，同時針對今后的發展方向和有待解決的問題提出了新的見解。希望對于從事中藥藥理學研究特別是中藥靶點確證的相關人員具有一定的指導和借鑒意義。

[關鍵詞] 中藥； 復雜體系； 靶點； 藥理機制； 光敏微球

[Abstract] Traditional Chinese medicine（TCM） is a complex system with multiple chemical compositions The most significant character of TCM is that the chemical compositions interact with each other by multitarget synergism to treat diseases Previous reports mainly focused on the investigation of single signaling pathway detection or the phenotypic analysis of proteomics difference； however， no studies have been conducted on the identification of direct targets of TCM Therefore， it is difficult to analyze the molecular mechanism of traditional Chinese medicine from the target source， and it is difficult to explain its traditional efficacy scientifically， thus seriously affecting its clinical application and internationalization In this article， we discussed the methodology for the identification of direct TCM targets（groups）， and presented the strategy for preparation of TCM chemical composition solid coupling beads， as well as of enrichment and identification strategy of target proteins based on photosensitive coupling technique We also discussed the advantages and limitations of this strategy， and put forward some new ideas for the future developments We hope this article can provide some guidance and reference significance for the researchers on TCM pharmacology study， especially on target identification.

[Key words] traditional Chinese medicine； complex system； drug target； pharmacological mechanism； photosensitive beads

中藥在我國的使用歷史悠久，長期積累了大量的臨床經驗，防病治病效果明確，因此在維持人們健康方面做出了巨大貢獻。但是時至今日中藥的使用和推廣還主要局限于中國、韓國、日本及東南亞地區，其國際化和現代化的步伐緩慢，特別是在歐美等發達國家的推廣和應用還受到不少的限制。究其根本，主要問題還在于中藥的成分十分復雜，藥理機制難以說清，藥物靶點不明，因此難以使用現代科學語言對其藥理作用和傳統功效進行精準的詮釋^[1-2]。

近年來，關于如何研究和理解中藥復雜體系藥理機制的探討一直在不斷進行，就此人們也提出了很多理論與假說。比如較為流行的中藥“多成分、多靶點”觀點認為，中藥由于其所含化學成分復雜多樣，因此每種化學成分都有各自的作用靶點，多個成分對應多個不同靶點，由此構成了中藥復雜體系的多成分、多靶點的作用模式^[3-4]。該觀點可以很好的解釋中藥成分多樣性所導致的作用機制復雜性的現象，同時也契合了不少實驗結果，因而已經成為目前中藥藥理學研究的重要模式之一。然而，近年來也有人提出中藥成分雖然復雜，但是未必一定是多成分、多靶點的看法。即中藥里所含的多個化學成分可能同時作用于1個靶點，而1個化學成分也可能同時作用于多個不同靶點的現象是存在的，甚至有時單一化學成分作用于多個靶點的現象在中藥里更為常見^[5]。這一觀點近幾年來也催生了一個新學科的出現，即多重藥理學（polypharmacology）^[6]。有學者認為，具有多重藥理作用的中藥活性分子由于其作用于疾病網絡中的多個靶點，多個靶點之間產生協同作用，進而導致綜合作用大于單個作用加和的效果，這可能更加有助于諸如心腦血管疾病、腫瘤、代謝性疾病及神經退行性疾病等多基因復雜疾病的治療^[7]。值得一提的是，新近還有學者針對中藥成分復雜性的特點提出了中藥復雜體系的 “顯效理論”，認為中藥活性成分可能通過“眾多顯效形式的單靶點疊加作用、多靶點協同作用”發揮整體藥效，同時各種中藥活性成分由于作用靶點的不同還可能產生“毒性分散作用”，進而削弱中藥自身的毒性^[8-9]。由此可見，這些觀點和理論的不斷提出，為中藥復雜體系的藥理機制研究與闡釋奠定了堅實的理論基礎和思想框架。因此有必要開展大量的實驗研究去驗證、支持和進一步豐富這些研究理念，從而使中藥復雜的藥理作用機制得以真正的闡明，并最終促進中藥的國際化。endprint

1 中藥復雜體系分子靶點研究的迫切性

近年來，隨著青蒿素研究獲得諾貝爾獎及中醫藥研究熱潮的復興，大量研究機構開展了針對諸多經典名方的藥理機制研究，致使一大批傳統中藥方劑的功效得到循證醫學的確認，作用機制也得到更深刻的認識。但是目前存在的主要問題是大多研究僅針對中藥方劑作用于細胞或機體后的所引起的整體蛋白質組、轉錄組以及基因組表達變化的表觀性研究，未能通過這些表觀信號指標的變化找到藥物分子的直接作用靶點，因此尚未真正意義的闡明藥物的分子作用機制。特別是面對像中藥這樣具有多種化學成分的復雜體系，其直接作用靶點或靶點群的研究更是困難，因此嚴重制約了中藥傳統功效的科學詮釋及現代化進程。

眾所周知，靶點是藥物作用于細胞和機體并產生疾病防治作用的生物學基礎，是藥物作用的源頭。只有弄清藥物分子的作用靶點并了解其生物學功能后，才能真正從根本上闡明該藥物的分子藥理機制，并進而指導臨床精準用藥^[10]。一般來講，藥物的靶點就是人體內的某些生物大分子，諸如蛋白質、核酸或糖類物質等。藥物通過靶向作用于這些生物大分子，調節其生物學活性，進而引起靶點分子下游的細胞信號通路的改變，進而擾動疾病網絡，發揮疾病治療和預防的作用^[11]。因此，藥物靶點的闡明和揭示，可以從源頭上弄清藥物的作用機制，對于全面認識和理解藥物具有重要的指導意義。

2 中藥復雜體系分子靶點研究現狀

目前，針對中藥分子靶點的研究尚未形成統一的思想框架。早期的探索性研究可能主要源于針對單一天然活性分子的作用靶點鑒定。比較知名的案例就是針對天然產物FK506的作用靶點蛋白FKBP的揭示，該研究是由哈佛大學的Schreiber教授領導完成的^[12]。此后逐步掀起了一股天然活性分子靶點的研究熱潮，包括紫杉醇^[13]，喜樹堿^[14]，嗎啡^[15]，石杉堿甲^[16]以及三氧化二砷^[17]的分子靶點相繼被發現。由此逐漸形成了一套較為成熟的天然活性分子的靶點研究策略，即“靶點垂釣”技術^[18-19]。該技術主要是通過化學修飾在原有分子結構中引入一個標簽分子，如生物素分子，進而利用生物素與固相載體表面的親和素之間的強相互作用，將與分子探針特異性結合的靶點富集到固相載體表面，并通過高分辨質譜對靶點進行鑒定。應用該技術進行藥物靶點確證時，需要對所研究的活性分子進行化學修飾，修飾過程中不能破壞該分子原有的藥效團，即合成的分子探針要保留原有的生物學活性，因此這一要求十分苛刻，并不適用于所有天然活性分子的靶點研究，因為很多天然活性分子沒有可供修飾的化學基團。因此，“靶點垂釣”技術僅適用于少數天然活性分子 [20]。

分子“靶點垂釣”技術對于單一分子的靶點研究尚且困難重重，其對于中藥方劑這樣復雜系統的靶點研究就更加無能為力。如果采用研究單一活性分子靶點的思路開展中藥復雜體系的多靶點鑒定與研究時，首先就需要將中藥復雜體系中的整個化學成分全部偶聯到固相載體上，進而才能進行后續的靶點富集與鑒定。而解決這一問題的關鍵就是如何將中藥所含的諸多不同結構的化學分子偶聯到固相載體上，采用傳統針對單一化學分子進行結構修飾進而引入標簽分子的策略顯然是行不通的。因此，近年來人們不斷開發出了一些基于其他技術手段的中藥作用靶點研究策略。

2.1 基于計算機虛擬對接技術的中藥尋靶方法 多年以前人們已經開始采用基于計算機虛擬對接技術的反相尋靶方法。通過首先明確中藥復雜成分體系中的主要活性成分，進而將他們的化學結構輸入計算機系統，依托后臺的靶點蛋白結構庫及分子對接軟件平臺進行虛擬分子對接，尋找與中藥活性分子對接打分較高的潛在作用靶點，最后將中藥活性分子對接得到的靶點進行匯總，即得到該中藥的作用靶點（群）。根據靶點群中不同靶點的生物學功能，還可以繪制靶點互作網絡，進而解釋中藥的復雜分子藥理機制^[21-22]。然而，該研究策略存在一個明顯的不足，即研究結果需要后期的實驗驗證，而這一驗證工作量很大，對于一些條件受限的實驗室有時甚至無法完成。

2.2 基于系統生物學的中藥尋靶方法 近年來，隨著系統生物學，基因組學和蛋白質組學技術的不斷發展，人們又嘗試采用各種組學技術來研究中藥復雜體系的藥理機制，特別是作用靶點。例如通過檢測中藥干預細胞或動物體系前后的整個蛋白質組水平的變化，進而通過各種生物信息學分析方法如GO基因功能注釋和KEGG通路注釋等，繪制藥物可能調控的信號通路，這樣沿著信號通路不斷向上追溯就可以找到該藥的作用靶點^[23-24]。例如有學者采用網絡藥理學等方法研究了中藥麝香保心丸的潛在作用靶點及對心血管系統的信號通路及疾病網絡的調控作用。結果發現麝香保心丸可能參與調控了523個不同的靶點蛋白，其中的28個入血成分對應了其中的113個靶點蛋白，包括COL1A1，MMP9，NOS3，TLR4以及VCAM1等。這些靶點之間通過相互協同作用，進而擾動疾病網絡，發揮抗心肌缺血所致的心絞痛和心肌梗死等疾病治療作用。對于像中藥這種組成十分復雜的藥物體系，基于組學的研究策略可以大大降低研究的時間，即在短期內即可找到與藥物相關的作用靶點并闡明其藥理機制。不過該方法也存在一些問題，即通過生物信息學計算找到的靶點可能僅是一些藥物間接調控的靶點，可能并不是藥物的直接作用靶點，因此有時還不能從源頭上解釋藥物的分子藥理機制，而目前針對該研究策略的不斷完善仍然在進行中。

2.3 基于化學生物學的中藥尋靶方法 通過化學生物學的手段開展復雜體系的藥物靶點識別近年來已經有所報道。尤其是通過細胞熱移位法（cellular thermal shift assay，CETSA）以及DARTS（drug affinity responsive target stability）技術開展的復雜體系藥物靶點研究較為突出。例如，DARTS技術被用來研究葡萄籽提取物的潛在作用靶點蛋白，結果發現葡萄籽提取物能夠靶向作用細胞內質網相關蛋白，例如GRP75，GRP78，HSP7c，ALDOA等，通過誘導內質網應激進而促進細胞內調控蛋白質翻譯過程的蛋白表達下調，最終發揮抗腫瘤作用^[25]。另外，本課題組也在嘗試使用細胞熱移位法并結合活細胞穩定同位素標記技術（SILAC）進行復雜中藥體系的尋靶研究，即通過對中藥提取物處理過的活細胞進行熱應激處理，然后通過SILAC定量蛋白質組學檢測藥物處理前后細胞中的蛋白穩定性變化，進而找到可能與中藥提取物發生潛在結合的靶點蛋白。endprint

3 基于固相親合載體的中藥復雜體系靶點研究策略

近幾年來，隨著光化學技術的不斷進步，人們發現了一系列具有光敏活性的化學基團，如二苯甲酮和三氟甲基取代氮雜環丙烷這些光敏基團的特點是可在紫外光激發下活化成碳自由基，而碳自由基可以高效的插入到化合物的碳氫鍵之間，形成共價偶聯^[26-27]。由于中藥活性成分中大多具有碳氫鍵，所以如果將光敏基團鍵合到固相載體（如微球、芯片）的表面，進而可以利用光反應活化這些光敏基團，實現將中藥活性成分偶聯到固相載體表面的設想。基于該策略，可以將中藥甚至整個方劑的所有化學成分整體鍵合到固相載體表面，并用于后續的靶點鉤釣與鑒定。

本課題組前期基于該靶點鉤釣策略研究并鑒定了多個中藥方劑、單味藥及其有效部位的作用靶點群。即將中藥的全化學成分組或有效部位成分通過光活化偶聯技術鍵合在固相磁性微球的表面，進而將被修飾的磁性微球與細胞或組織裂解液進行共孵育，通過固定在微球表面的中藥化學分子與靶點之間的特異性相互作用，將不同的靶點富集到固相微球的表面，再通過特異性洗脫將靶點從微球表面剝離下來，進行高分辨質譜鑒定與分析，從而得到該中藥化學成分組對應的靶點群（圖1）。此外，基于鑒定得到的不同靶點，開展生物信息學分析，筆者進而發現了一系列與所發現靶點群相關的細胞信號通路，依據這些信號通路所反映的生物學功能進而推測了這些中藥發揮藥效作用的潛在分子藥理機制。這種通過光偶聯技術將中藥化學成分組整體鍵合到固相載體表面，進而鉤釣相應靶點，并依據生物信息學分析手段探討這些靶點所反映的生物學功能及藥理調控網絡，進而詮釋中藥傳統功效的策略在以往的中藥研究中尚未見廣泛報道。

該方法最大的特色在于其可以發現中藥復雜體系的直接作用靶點，進而可以從靶點源頭上解釋中藥的藥理機制。此外，依據這一策略所揭示的是針對整個中藥化學成分組的靶點群，因而體現了中藥的整體作用特點。更值得一提的是，依據該方法還可以通過將不同中藥活性成分或同一中藥的不同活性分子分別偶聯到不同的微球上，分別鉤釣其對應的靶點并與總方的作用靶點群進行比較，進而研究同一方劑內部不同藥物之間的配伍關系，或同一中藥的不同活性成分之間的協同作用，進而深入揭示中藥調控機體發揮疾病治療作用的復雜藥理機制。

4 基于固相親合載體的中藥復雜體系分子靶點研究所面臨的問題及挑戰

基于光偶聯技術構建中藥化學成分親合載體并進行分子靶點鑒定的策略目前還僅是針對某一中藥或方劑的全化學成分組的靶點研究，這里尚未考慮到藥物的體內吸收和代謝轉化等因素的影響^[28]。由于中藥的化學成分并不能被機體全部吸收入血，因此只有部分成分在體內可作用于其特定的靶點，此外由于藥物經過體內代謝后可能部分原型化合物的結構發生了變化，因此其作用的靶點也可能隨之發生變化，或該化合物針對某個靶點的作用強度亦隨之發生變化。因此基于目前的研究策略所發現的作用靶點可能要多于中藥在體內實際作用的靶點數。因此期待今后進一步結合中藥的體內吸收和代謝特點進而有針對性的將中藥吸收進入體內的化學組分篩選出來，并偶聯到固相載體表面，這樣鑒定得到的靶點將更加特異、更有針對性，更能真實的反映中藥在體內的作用機制。另外值得注意的是，中藥吸收入血后，還存在不同器官分布的特點^[29]，因此研究過程中可能要考慮到針對不同器官制備特異性的組織裂解液，同時針對進入某一特定器官的特定化學成分制備固相親合載體，進而更加精準的開展中藥靶點鑒定和研究工作。此外，筆者也在積極探討是否可將用于偶聯中藥活性成分的固相磁性微球做的更小，比如達到納米級別，這樣可以直接將該微球通過注射方式進入體內，然后獲取某一特定器官的裂解液，進而通過磁性富集的方式富集體內的磁性標記藥物，并分析與藥物結合的潛在靶點蛋白，即在體狀態下直接開展靶點鑒定工作。

5 結語

目前針對中藥活性成分單體的分子靶點鑒定方法已經十分成熟，但是如何鑒定中藥特別是中藥方劑等復雜成分體系的作用靶點的研究尚未廣泛開展，其中的關鍵瓶頸就在于如何將中藥復雜化學成分進行芯片偶聯與固定，進而開展后續的靶點鑒定。除了基于光偶聯技術外，目前還有一些其他方法處于嘗試階段，比如通過環氧活性基團與含糖環化學分子進行偶聯^[30]以及物理性吸附^[31]等手段。但是這些方法均未引起廣泛關注，因此有必要對此進行深入探討，進而發現更多的針對中藥復雜化學成分體系的多靶點研究策略，這些嘗試將對今后中藥分子藥理機制研究具有十分重要的指導意義。

[參考文獻]

[1] 李儀奎.中藥藥理世紀回眸[J]. 中成藥， 2000， 22（1）： 59.

[2] 寇俊萍，柴程芝，余伯陽.中藥藥理研究進展[J]. 藥學進展，2013，37（9）：428.

[3] 夏青，孫雪飛，趙海娟，等.中藥多組分、多靶點作用機制研究進展[C]. 北京：中華中醫藥學會中藥化學分會第八屆學術年會，2013：285.

[4] 王勇，李春，仇琪，等.中藥復方多成分多靶點協同增效藥理藥效評價體系[J]. 中國科學：生命科學，2016，46（8）：1029.

[5] 杜冠華，王月華，張冉，等.多成分多靶點是對中藥作用機制的表面認識[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化，2009，11（4）：480.

[6] 許玉龍，邵黎明.多重藥理學：藥物發現的新理念[J]. 中國藥物化學雜志，2016， 26（4）：342.

[7] Chaudhari R， Tan Z， Huang B， et al. Computational polypharmacology： a new paradigm for drug discovery[J]. Expert Opin Drug Discov， 2017， 12（3）： 279.endprint

[8] 蔡少青，王璇，尚明英，等.中藥“顯效理論”或有助于闡釋并弘揚中藥特色優勢[J]. 中國中藥雜志，2015，40（17）：3435.

[9] 徐風，楊東輝，尚明英，等.中藥藥效物質的“顯效形式”、“疊加作用”和“毒性分散效應”——由中藥體內代謝研究引發的思考[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化， 2014，16（4）：688.

[10] 江振洲，楊婷婷，李曉驕陽，等.藥物作用靶點研究最新進展[J]. 藥學進展，2014，38（3）：161.

[11] 趙靜，張衛東.基于系統生物學的多靶點及多組分藥物研究的進展[J]. 中國藥學雜志，2010，45（15）：1121.

[12] Harding M W， Galat A， Uehling D E， et al. A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase[J]. Nature， 1989， 341（6244）： 758.

[13] Vindya N G， Sharma N， Yadav M， et al. Tubulins-the target for anticancer therapy[J]. Curr Top Med Chem， 2015， 15（1）： 73.

[14] Khadka D B， Cho W J. Topoisomerase inhibitors as anticancer agents： a patent update[J]. Expert Opin Ther Pat， 2013， 223（8）： 1033.

[15] Terenius L， Wahlstrm A. Search for an endogenous ligand for the opiate receptor[J]. Acta Physiol Scand， 1975， 94（1）： 74.

[16] Zhang H Y， Tang X C. Neuroprotective effects of huperzine A： new therapeutic targets for neurodegenerative disease[J]. Trends Pharmacol Sci， 2006， 27（12）： 619.

[17] Zhang H N， Yang L， Ling J Y， et al. Systematic identification of arsenic-binding proteins reveals that hexokinase-2 is inhibited by arsenic[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2015， 112（49）： 15084.

[18] 張煚，周虎臣.小分子探針在確定活性化合物的生物靶點中的應用[J]. 藥學學報，2012，47（3）：299.

[19] 陳樹強，董國強，盛春泉，等.活性小分子化合物靶點驗證方法的研究進展[J]. 藥學實踐雜志，2016，34（2）：97.

[20] 屠鵬飛，曾克武，廖理曦，等.天然活性小分子靶標蛋白識別方法學研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2016，41（1）：6.

[21] 孟志昌，周雪忠，雷蕾，等.基于計算的中藥靶點預測研究探討與實驗分析[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化，2014，16（11）：2296.

[22] 徐筱杰.計算多靶藥理學及其在中藥研究中的應用[C]. 廈門：中國化學會第27屆學術年會， 2010：6.

[23] 楊紅芹，李學軍.化學蛋白質組學與藥物靶點的發現[J]. 藥學學報，2011，46（8）：877.

[24] 黃春洪，孔毅，段濤，等.蛋白質組學技術與藥物作用新靶點研究進展[J]. 中國藥學雜志，2005，40（8）：564.

[25] Derry M M， Somasagara R R， Raina K， et al. Target identification of grape seed extract in colorectal cancer using drug affinity responsive target stability （DARTS） technique： role of endoplasmic reticulum stress response proteins[J]. Curr Cancer Drug Targets， 2014，14（4）：323.

[26] 康慧，劉蓮英，楊萬泰.表面接枝二苯甲酮光活性聚合物及光化學固定大分子的研究[J]. 北京化工大學學報：自然科學版，2011，38（5）：75.

[27] Kotake Y， Sagane K， Owa T， et al. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide[J]. Nat Chem Biol， 2007， 3（9）： 570.

[28] 祖先鵬，林璋，謝海勝，等.中藥有效成分與腸道菌群相互作用的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2016，41（10）：1766.

[29] 高潔，王素娟，徐瑞明，等.成分體內吸收分布特點指導的中藥藥效物質研究探索[J]. 中國科技論文，2006，1（4）：276.

[30] Liu L， Hua Y， Wang D， et al. A sesquiterpene lactone from a medicinal herb inhibits proinflammatory activity of TNF-α by inhibiting ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5[J]. Chem Biol， 2014， 21（10）： 1341.

[31] Bailey S N， Sabatini D M， Stockwell B R. Microarrays of small molecules embedded in biodegradable polymers for use in mammalian cell-based screens[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101（46）： 16144.

[責任編輯 張寧寧]endprint