以腦源性神經營養因子等干預視神經損傷大鼠視神經拉伸力學的特性分析*

王玲，呂雪漫，姜琦

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

1 引 言

目前視神經損傷的治療方法存在著較大的爭議［1］。近年來，以干細胞干預治療視神經損傷已在實驗動物中取得了一定的療效［2］。關于人臍血干細胞（human umbilical cord blood stem cells，hUCBSC）對于視神經損傷的干預治療，周丹［3］對外傷性視神經部分損傷模型大鼠以人臍血干細胞和神經營養因子干預治療效果進行了研究，得出了人臍血干細胞和神經營養因子具有促進恢復外傷性視神經損傷動物模型視神經傳導功能的結論。尹成玉等［4］對臍血間充質干細胞干預治療視神經損傷的療效進行了觀察，得出了臍血間充質干細胞干預治療視神經損傷患者后視力均有改善的結論。關于人腦源性神經營養因子干預治療視神經損傷動物模型，劉勇等［5］以人腦源性神經營養因子干預治療視神經損傷動物模型，得出了人腦源性神經營養因子移植視神經損傷動物模型后hBDNF—GFP—NSCs可以分化為神經膠質細胞、神經元外，少數可分化為視網膜神經節樣細胞；移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs存活的結論。Lv等［6］對以腦源性神經營養因子、人臍血干細胞干預視神經損傷動物模型家兔視神經的應力松弛、蠕變特性進行了研究，得出了hUCBSC和BDNF具有恢復視神經損傷動物模型應力松弛、蠕變特性的作用和干預治療視神經損傷動物模型效果明顯的結論。

本研究以鉗夾法制備視神經損傷動物模型，分別以腦源性神經營養因子和人臍血干細胞進行干預治療，以拉伸力學性能指標判斷以腦源性神經營養因子、人臍血干細胞干預治療視神經損傷模型動物的效果，旨在為視神經損傷的治療提供生物力學基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

健康7月齡，體質量330～340 g雌性SD大鼠60只，由吉林大學動物實驗中心提供。在籠中飼養各組大鼠，大鼠飼養室溫度23～25℃，室內保持空氣流通，自然光照，室內相對濕度60～72%，實驗前對大鼠眼底和外眼進行檢查，對無病變大鼠納入實驗。

2.2 實驗大鼠分組

60只SD大鼠隨機分為視神經損傷動物模型組20只，視神經損傷動物模型以BDNF干預組20只，視神經損傷模型以人hUCBSC干預組20只，在60只大鼠中隨機取20只正常眼（左眼）設為正常對照組。.

2.3 視神經損傷大鼠模型的制備

按文獻［7］的方法建立視神經損傷大鼠模型，大鼠俯臥位固定于手術臺上，向大鼠腹腔內注射0.1%的烏拉坦（5 mg/kg）水合氯醛，麻醉大鼠后將大鼠右眼頂側眶上皮膚切開，露出眶壁和眶上緣切跡，在眶上緣切跡處將視神經管方向兩側部分眶壁骨板（寬5 mm，深6～7 mm）切除，將后部眼球筋膜剪開，沿上直肌向球后分離，使眼球后視神經暴露。在離后極部約3 mm游離視神經約4 mm，以上海醫療器械廠生產的W40160恒定壓力反向血管夾（相當于98 g）鉗夾同一部位的視神經10 s。用慶大霉素液沖洗術野10次后，以青島耐克醫材有限公司生產的10～0號尼龍線分層縫合。術后在大鼠眼結膜囊內涂紅霉素眼膏。

2.4 視神經損傷動物模型造模成功標準

視神經損傷動物模型造模后立即觀察，將大鼠視網膜血管無出血或梗塞，傷眼瞳孔散大間接對光反射存在，直接對光反射消失作為造模成功的大鼠納入實驗。

2.5 藥物干預

對視神經損傷動物模型以BDNF干預組大鼠于造模7 d后［7］，以瑞士哈美頓公司生產的微量注射器向大鼠玻璃體內一次性注射上海酶聯生物科技有限公司生產的腦源性神經營養因子BDNF 50 ng。對視神經損傷大鼠以hUCBSC干預組大鼠于造模7 d后，用以瑞士哈美頓公司生產的微量注射器向大鼠玻璃體內一次性注射深圳北科生物公司生產的hUCBSC 106個［7］。

2.6 視神經試樣取樣方法

建模30 d后處死各組大鼠，在YZ6F直接檢眼鏡下，以手術刀切取大鼠眶內段同一部位視神經各16個，將視神經試樣置于裝有生理鹽水的器皿內，置于4℃冰箱內保存。

2.7 電子顯微鏡觀察大鼠視神經組織形態方法

按文獻［8］的方法取各組大鼠眶內同一部位視神經各一條，長為5 mm，先以戊二醛（4%）前固定，之后以鋨酸（1%）后固定，以丙酮梯度進行脫水，然后進行臨界點干燥，之后進行真空噴金鍍膜，以德國卡爾蔡司公司生產的MERLIN Compact型場發射掃描電鏡觀察各組視神經的組織形態。

2.8 各組大鼠視神經試樣一維拉伸實驗方法

以長春試驗機研究所集團生產的MODEL55100型電子拉力試驗機對各組大鼠視神經試樣進行一維拉伸實驗，以讀數顯微鏡測量各組大鼠視神經試樣的長度和直徑，各組試樣長度均為10 mm，直徑為0.82～0.88 mm。按文獻［7］的方法分別對每個大鼠視神經試樣進行預調處理。各組大鼠視神經試樣拉伸實驗環境溫度為36.5±1.0℃，分別將各組大鼠視神經試樣裝夾于試驗機的軟組織夾頭內，以1 mm/min的載荷增加速度對視神經試樣進行拉伸，實驗結束后，計算機自動輸出視神經試樣的拉伸實驗數據和曲線。

2.9 統計學分析方法

以美國SPSS16.0軟件包（SPSS，Chicago，IL，USA）進行數據分析，計量資料以mean±SD表示，組間數據差異的比較采用單因素方差分析法和Sceffe法，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結果

3.1 掃描電鏡觀察各組視神經的組織形態結果

各組視神經的組織形態掃描電鏡觀察結果見圖1。

圖1 正常對照組、視神經損動物模型組、視神經損傷動物模型以hUCBSC治療組、視神經損傷動物模型以DBNF治療組視神經電子顯微鏡照片（×100）。Fig 1 The normal control group，the optic nerve injury model group，the optic nerve injury animal model group treated with hUCBSC，the optic nerve injury animal model treated with DBNF（×100）.

掃描電鏡觀察結果表明，正常對照組視神經軸突等內容物形態清晰，細胞核均勻，無增大、無明顯水腫，無炎癥細胞，見圖1a。視神經損傷動物模型組視神經結構模糊，纖維排列稀疏，軸突、核碎裂軸突等的組織形態發生了改變，見圖1b。視神經損傷動物模型以BDNF治療組視神經部分膠質細胞核排列不規則，有少量細胞空泡，部分神經纖維排列較整齊，軸突形態有一定的恢復，神經纖維迂曲、偶見胞核碎片，視神經無明顯變細，見圖1c。視神經損傷動物模型以hUCBSC治療組視神經纖維排列較密集，膠質細胞核增多，多數軸突形態正常，見圖1d。

3.2 各組大鼠視神經一維拉伸實驗結果

各組大鼠視神經一維拉伸實驗結果見表1。

表1 各組大鼠視神經一維拉伸實驗結果（n＝15）Table 1 Tensile test results of optic nerve in rats of each group（n＝15）

結果用mean±SD表示，每組15個樣本，aP＜0.05，vs.正常對照組；bP＜0.05，vs.視神經損傷動物模型組；cP＜0.05，vs.視神經損傷動物模型以BDNF治療組；dP＜0.05，vs.視神經損傷動物模型以hUCBSC治療組。

各組大鼠視神經一維拉伸實驗結果表明，視神經損傷模型以BDNF干預組動物視神經的最大載荷、最大應力、最大應變、彈性限度載荷、彈性限度應力小于視神經損傷模型以hUCBSC干預組，差異顯著（P＜0.05）。視神經損傷動物模型組視神經的拉伸最大載荷、最大應力、最大應變、彈性限度載荷、彈性限度應力小于視神經損傷模型以hUCBSC、以BDNF干預組差異顯著（P＜0.05）。

3.3 各組大鼠視神經一維拉伸應力-應變曲線

各組大鼠視神經一維拉伸應力-應變曲線見圖2。

圖2 各組大鼠視神經一維拉伸應力-應變曲線Fig 2 The stress-strain curves of optic nerve in rats of each group

3.4 各組大鼠視神經應力-應變函數關系表達式的建立

由各組視神經拉伸實驗得出的應力、應變數據，分別建立各組大鼠試樣的應力-應變函數關系表達式如下：

正常對照組：σ（ε）＝26054e5-73.00e4＋67.75 e3-13.07＋1.632

視神經損傷動物模型組：σ（ε）＝35.29e5-76.28e4＋54.03e3-4.64e2＋0.83

以hUCBSC干預治療組：σ（ε）＝46.89e5-117.18e4＋95.54e3-18.84e2＋2.23

以BDNF干預治療組：σ（ε）＝61.46e5-137.36e4＋100.72e3-17.99e2＋2.00

4 討論

各組大鼠視神經組織形態觀察結果發現，視神經損傷動物模型組視神經結構模糊，纖維排列稀疏，軸突、核碎裂軸突等的組織形態發生了改變。視神經損傷動物模型以BDNF干預治療組視神經部分膠質細胞核排列不規則，有少量細胞空泡，部分神經纖維排列較整齊，神經纖維迂曲、偶見胞核碎片，視神經無明顯變細。視神經損傷模型以hUCBSC干預治療組視神經大面積神經纖維排列較密集，膠質細胞核增多，軸突形態多數正常。說明BDNF、hUCBSC對恢復損傷視神經的組織形態具有一定的作用，hUCBSC恢復損傷視神經組織形態的作用好于BDNF。

各組大鼠視神經拉伸實驗結果表明，視神經損傷動物模型組大鼠視神經的拉伸力學性能發生了改變，視神經損傷動物模型通過以hUCBSC和以BDNF干預治療后，提高了視神經損傷模型大鼠視神經的拉伸力學性能指標，視神經的生理功能要求其神經纖維結構保持完整；具有完整結構的視神經才具有一定的承受變形和載荷的能力；如果神經纖維局部受到損傷或被切斷，會使視神經部分或全部喪失承受變形和載荷的能力［7］。分析認為，視神經損傷模型大鼠視神經損傷后，正常視神經纖維排列不規則，結構紊亂，組織形態發生了改變，使其力學性能發生了改變。

李云琴等［9］研究了以hUCBSC干預視神經損傷動物模型后的效果，得出了視神經損傷模型大鼠玻璃體腔注射hUCBSC可減緩視網膜中RGC的凋亡，對RGC具有保護作用的結論。臍血間充質干細胞可向其它組織分化，具有移植后免疫排斥反應低的特點，間充質干細胞已廣泛的應用于生物工程和醫學領域［10］。

BDNF對神經活動起著重要作用，視神經損傷后其節細胞損傷及死亡的一個很重要的原因是切斷了遠端長期供應膠質細胞的神經營養因子，使RGCS營養不良而死亡，如果及時補充外源性的神經營養因子，損傷的RGCS仍能較好地生長［11］，研究證實，損傷后的神經系統，補充神經營養因子后可以促進軸突再生和神經元存活［12］。本研究通過以hUCBS對視神經損傷動物進行干預治療后，分泌了多種神經營養因子，增加了神經損傷區的膠質細胞，對破壞的視神經組織形態有所改變，力學性能指標也有一定的提高。

本研究發現，損傷的視神經的組織形態恢復的越好，力學性能指標恢復的越好，本研究得出的視神經的組織形態觀察結果、拉伸實驗結果證明視神經損傷模型以hUCBSC、以BDNF干預治療后對視神經損傷模型動物的視神經組織形態、力學性能指標具有提高的作用，說明hUCBSC、BDNF干預治療對視神經損傷模型大鼠均具有一定的療效，但hUCBSC的干預治療效果更好。