青蒿琥酯對小鼠氣道阻力及氣道平滑肌牽張力的效應研究*

張藝凡，王悅△，劉磊，李晶晶，鄧林紅△

（1.常州大學生物醫學工程與健康科學研究院暨常州市呼吸醫學工程重點實驗室，常州213164；2.常州大學 制藥與生命科學學院／護理學院，常州213164）

1 引 言

哮喘主要病理特征表現為氣道炎癥、氣道重構及氣道高反應性，氣道平滑肌細胞（ASMC）是參與氣道高反應（AHR）的主要細胞類型［1］，舒張氣道平滑肌，減輕氣道狹窄是目前治療哮喘的主要方法。但治療哮喘的藥物存在心動過速，骨質疏松等諸多不良反應，價格也相對昂貴，因此有必要尋找既經濟又有效的治療哮喘藥物，如中草藥。近年來研究發現，在氣道平滑肌上存在苦味受體（Bitter taste receptors，TAS2Rs），當苦味物質如糖精和氯喹等與TAS2Rs結合后能舒張 ASMC，改善 AHR癥狀［2］，其支氣管舒張效果甚至強于已用于臨床的β2受體激動劑［3－4］。青蒿琥酯是著名的抗瘧藥青蒿素的衍生物，也是廣為人知的苦味物質，可抑制小鼠哮喘模型的氣道炎癥［5］，但其是否對氣道阻力及平滑肌的牽張力有影響未見報道。本研究建立了小鼠哮喘動物模型，在體內和體外實驗檢測了青蒿琥酯對小鼠氣道阻力和氣道平滑肌牽張力的效應，并初步探討了效應機制。

2 材料和方法

2.1 試劑與動物

2.1.1 實驗動物 6～8周齡雌性Balb／c小鼠，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（蘇）－2016－0010。

2.1.2 實驗試劑及材料 青蒿琥酯，Ι型膠原（Sigma－Aldrich）；DMEM培養基，胎牛血清，雙抗（Gibco）；其余試劑從Fisher Scientific獲得；倒置顯微鏡（NIKON）；LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡（Carl Zeiss）；FV－FX1.3小動物肺功能檢測儀（SCIREQ）。

2.2 OVA誘導BALB／c小鼠急性哮喘模型

BALB／c小鼠在第1、8 d腹腔注射200μL含氫氧化鋁干粉（2%）和OVA（0.02%）致敏劑，每天用50 mg／ml的OVA激發20 min，持續2周；對照組以生理鹽水代替致敏劑［6］。所有實驗組均在末次激發結束24 h之后，進行肺功能及相關指標檢測。

2.3 哮喘模型小鼠肺組織病理學檢測

將哮喘模型小鼠右肺取出，4%福爾馬林浸泡過夜，并在分級系列乙醇溶液中脫水。經包埋，切片，展片，HE染色后光學顯微鏡下進行形態分析。收集小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行炎癥細胞分類及總細胞的計數。

2.4 小鼠氣道阻力的測定

小鼠麻醉狀態下進行氣管插管手術，用侵入式的FlexiVent小動物肺功能檢測儀檢測正常組和OVA組小鼠在乙酰甲膽堿（Mch）激發下氣道阻力的變化。小鼠霧化吸入 0、2、8、32、64、128 mg／ml的Mch，當氣道阻力達到基線4～5倍時，再分別霧化吸入青蒿琥酯（30，60，120μg），沙丁胺醇（3μg）和鹽酸奎寧（150μg），通過肺功能檢測儀每30 s測量一次氣道阻力，持續 5 min［7］。

2.5 小鼠原代氣道平滑肌細胞的分離培養

解剖BALB／c小鼠取出肺葉組織，用無菌器械從外膜表面分離結締組織，上皮層，纖維層及粘膜層組織，縱向剖開支氣管，去除內膜后剪成1 mm2組織塊，移至培養瓶中倒置6～8 h后加入適量培養基，待細胞爬出后生長約至90%時進行傳代，純化，鑒定［8］。

2.6 小鼠氣道平滑肌細胞牽張力的測定

使用傅里葉變換牽引力顯微術（fourier transform tractionmicroscopy，FTTC）來量化ASMC的牽張力。將ASMC（2000個／皿）接種到涂有 I型膠原（0.1 mg／m l）的聚丙烯酰胺凝膠培養皿上培養24 h后，更換無血清培養基繼續培養12 h后進行實驗。通過相差顯微鏡和熒光顯微鏡分別記錄單個細胞和熒光微珠標記物的對照圖像，且每隔30 s采集一次微珠位置的熒光圖像［9］。

2.7 小鼠氣道平滑肌細胞的胞內鈣離子濃度測定

將小鼠ASMC接種到共聚焦玻璃皿底中（10000個／皿），貼壁后加入5μM膜滲透性［Ca2＋］i敏感熒光染料Fluo－4乙酰氧基甲基酯（Fluo－4AM）Ca2＋指示劑，孵育60 min。用 Tyrode溶液洗滌細胞3次后再孵育20 min使細胞質基質完全脫脂。將激發波長設定為488 nm，發射波長設定為＞505 nm進行熒光測量［10］。以刺激前細胞內［Ca2＋］i為基線，測定時間為20 s，再在共聚焦專用皿中分別加入各種不同濃度（0，0.375，0.75 mM）青蒿琥酯，觀察并記錄加入藥物后熒光強度瞬間動態變化。

2.8 統計分析

實驗數據采用平均數±標準差（±SD）表示，采用Origin 7.5進行統計學分析，各組組間組內的差異比較均用單因素方差分析，以P＜0.05作為顯著性差異的標準。

3 結果

3.1 OVA誘導BALB／c小鼠哮喘模型的鑒定

正常組小鼠的肺組織中可以清楚看到開放的氣道腔，少量炎癥細胞浸潤（見圖1A）；OVA組小鼠的肺切片出現明顯的組織重構，包括平滑肌明顯增厚，支氣管（Br）和血管周圍的嗜酸性細胞聚集（見圖1B）。OVA組小鼠肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細胞總數及嗜酸性細胞均顯著增加，呈過敏性哮喘典型的嗜酸性氣道炎癥（見圖1C，Eos：嗜酸性細胞；Neu：中性粒細胞；Lym：淋巴細胞；Mac：巨噬細胞）。

圖1 正常組和OVA組Balb／c小鼠的肺組織病理學鑒定（A－B.bar＝100μm；n＝4，**P＜0.01；*P＜0.05）Fig 1 Characterization of lung histopathology of normal and OVA－treated Balb／c mice

3.2 OVA致敏小鼠氣道阻力的測定

如圖2所示，Mch誘導的小鼠氣道阻力增加呈現劑量依賴性，OVA組小鼠的響應程度大于正常組，在OVA組和正常組小鼠中最大支氣管收縮達到基線的4～5倍時Mch劑量分別為64，128 mg／mL。這些結果同樣證實OVA組小鼠顯示過敏性哮喘表型的標志，因此適合于評價青蒿琥酯的支氣管擴張功效的研究。

圖2 正常組和OVA組小鼠氣道阻力的比較 （n＝4，*P＜0.05）Fig 2 Com parison of airway resistance of normal and OVA－treated Balb／c mice

3.3 青蒿琥酯對小鼠氣道阻力的影響

支氣管擴張劑沙丁胺醇，苦味受體激動劑奎寧鹽酸鹽能有效地將氣道阻力減少約50%，青蒿琥酯劑量從30μg增加到120μg時，正常組和OVA組小鼠氣道阻力逐漸降低。120μg青蒿琥酯使正常組小鼠氣道阻力從431.43±85.67%降至242.34±11.1%，OVA組小鼠氣道阻力從506.84±40.33%降至273.964±17.98%。青蒿琥酯（120μg）的支氣管擴張的功效與沙丁胺醇（3μg）相當。

圖3 青蒿琥酯對正常組和OVA組小鼠氣道阻力的影響（n＝5；**P＜0.01）Fig 3 Effect of artesunate on airway resistance of normal or OVA－treated mice

3.4 氣道平滑肌細胞的鑒定

如圖4所示，形態學上單個細胞呈梭形狀，細胞群呈現典型的“峰－谷”形態（圖4A），細胞骨架相對連續且具有一定的方向性（圖4B），α－actin免疫細胞免疫熒光鑒定結果顯示細胞的應力纖維呈絲狀，90%以上的細胞為平滑肌細胞（圖4C，D）。

3.5 青蒿琥酯對氣道平滑肌細胞牽張力的效應

圖5A－C分別是粘附在涂覆有I型膠原的聚丙烯酰胺凝膠表面的單細胞相差圖，熒光微珠圖，以及使用傅立葉變換牽引技術（FTTC）從位移場中計算出的牽引場和相應的牽引力分布圖。從表1可知，ASMC牽張力隨著青蒿琥酯濃度增加而逐漸降低。

表1 青蒿琥酯濃度對ASMC牽張力的影響（n＝4）Table 1 Effect of concentration of artesunate on traction force generated by the cultured ASM cells

圖4 體外培養Balb／c小鼠平滑肌細胞的鑒定A.原代培養（×20）；B.F－actin骨架染色（×63，油鏡）；C－D.α－actin免疫細胞免疫熒光（C：×20；D：×63，油鏡）Fig 4 Characterization of the culture ASM cells from Balb／c mice

圖5 青蒿琥酯對ASMC牽張力的效應（n＝4）Fig 5 Effect of artesunate on traction force generated by the cultured ASM cells

3.6 青蒿琥酯對氣道平滑肌細胞胞內鈣離子濃度的影響

圖6A表示在0.75 mM鹽酸奎寧處理前后的代表性細胞熒光圖像，胞內鈣熒光強度在0～75 s內先增強后減弱。但0.75 mM青蒿琥酯處理后，在0～120 s內熒光強度逐漸增強，并且到150 s時一直維持在較高的水平。ASMC瞬態胞內［Ca2＋］i以及峰值均以劑量依賴性方式響應青蒿琥酯（見圖6C－D）。

圖6 青蒿琥酯激發Balb／c小鼠氣道平滑肌細胞胞內［Ca2＋］i變化A.加入0.75 mM奎寧后胞內［Ca2＋］i隨時間變化的圖像；B.加入0.75 mM青蒿琥酯后胞內［Ca2＋］i隨時間變化的圖像；C.不同濃度青蒿琥酯作用于ASMC胞內［Ca2＋］i瞬態變化；D.不同濃度青蒿琥酯在150 s時的［Ca2＋］i值.F0.胞內［Ca2＋］i的基底值；F.給藥后胞內［Ca2＋］i的實時值.n＝4，**p＜0.01）Fig 6 Artesunate evoked［Ca2＋］i flux in ASM cells from Balb／c mice

4 討論

氣道高反應性是指因炎癥氣道出現過度敏感及過強的氣道平滑肌收縮反應，引起氣道狹窄和氣道阻力增加，從而引發咳嗽、呼吸困難、喘息等癥狀。氣道平滑肌的生物力學性質在哮喘氣道高反應和氣道狹窄中起了決定性的作用［11］，因此有效舒張氣道平滑肌，降低氣道阻力是治療哮喘的關鍵環節。本實驗選用眾所周知的苦味物質青蒿琥酯進行體內和體外實驗，發現其能使哮喘模型小鼠ASMC牽張力下降，從而舒張氣道，降低氣道阻力。

本研究表明，青蒿琥酯對小鼠氣道阻力和ASMC的舒張程度呈現劑量依賴性。小鼠正常組和OVA哮喘模型組霧化吸入青蒿琥酯均可使Mch誘導的氣道阻力得到有效緩解，且呈劑量依賴性。當青蒿琥酯劑量達到120μg，降低哮喘組小鼠氣道阻力的程度相當于3μg沙丁胺醇（常規哮喘治療）的效果。我們還使用傅里葉變換牽張力顯微術（FTTC）來量化ASMC產生牽張力的能力。FTTC是近來被廣泛用于測定ASMC在受到收縮劑（組胺）或舒張劑（異丙腎上腺素）刺激時收縮／舒張效應的技術方法［9］。FTTC研究結果顯示，體外培養的ASMC牽張力隨著青蒿琥酯濃度（0，0.375，0.75 mM）的增加而逐漸降低。有研究報道苦味物質鹽酸奎寧作為苦味受體激動劑能以劑量依賴方式降低ASMC產生的細胞牽張力，這可能是與 ASMC中表達的TAS2R靶向結合產生的舒張效應［3，12］。據調查，用于實驗檢測的苦味受體激動劑的化學結構式是相似的，都有氧，羰基和羥基官能團，且含有多個環，比如糖精和鹽酸奎寧都能在不同程度降低小鼠的氣道阻力，減小 ASMC牽引力，增加 ASMC的［Ca2＋］i應答。據此，苦味物質青蒿琥酯很可能也是靶向結合苦味受體產生了對氣道平滑肌的舒張作用。本研究中所用青蒿琥酯的劑量達到120μg，可能與目前采用的青蒿琥酯生物活性較低、苦味受體對青蒿琥酯的敏感性差等原因有關，將來需采用改進劑型、藥物分子修飾等方法增強青蒿琥酯的活性、以及增強其與苦味受體的相互作用等進一步改善青蒿琥酯對哮喘的治療作用。

本研究通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到青蒿琥酯濃度從0.25 mM增加到1.0 mM時誘導ASMC中［Ca2＋］i增加，青蒿琥酯的［Ca2＋］i響應趨勢與已知苦味受體激動劑鹽酸奎寧，糖精和柚皮苷的一致［3，13］。TAS2R激動劑如鹽酸奎寧是通過細胞膜介導的局部［Ca2＋］i響應，激活大電導鈣離子依賴的K＋（BKCa）通道，從而導致膜超極化和ASMC的舒張［3，14－17］。基于這些苦味物質之間的相似性，青蒿琥酯誘導的ASMC舒張效應也可能同樣是由于細胞膜超極化使得局部［Ca2＋］i反應而導致的，這種潛在機制還有待進一步的研究證明。