高效液相色譜-質譜法測定啤酒中伏馬毒素含量

湖南省長沙市疾病預防控制中心（410004）汪瓊 嚴付華 文剛

伏馬毒素是由串珠鐮刀菌產生的水溶性代謝產物[1][2]，由多氫醇和丙三羧酸組成結構類似的雙酯化合物[2][3]。伏馬毒素類似物主要以FB1、FB2、FB3形式存在。毒理學表明：伏馬毒素可導致馬腦白質軟化癥，豬肺水腫癥及食道癌等疾病，是繼黃曲霉毒素后又一食品安全研究熱點。由于這些真菌毒素能感染大麥、玉米等作物，且可通過這些原料最終進入啤酒中，導致啤酒食品安全問題。目前我國尚未制定相關食品中伏馬毒素的限量標準。因此建立一種快速、簡便、準確、高效的測定啤酒中伏馬毒素含量的方法尤為必要。

伏馬毒素的主要檢測方法有：薄層色譜法、近紅外光譜法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等。其中薄層色譜靈敏度較低；近紅外光譜重復性較差；基于氣相色譜類的方法步驟繁瑣；液相色譜法需衍生，耗費溶劑較多。液相色譜-質譜法具有較高的靈敏度和選擇性，無需衍生、水解，國內已有報道該法測定食品中的伏馬毒素，鮮有關于啤酒中伏馬毒素測定方面報道。因此本文建立免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-質譜法測定啤酒中的伏馬毒素FB1、FB2、FB3含量，為保障啤酒的安全和質量提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 H-class UPLC超高效液相-XEVO TQD串聯三重四級桿質譜儀（美國Waters公司）；MultiSep? 211 Fum凈化柱；0.22μm有機系微孔濾膜過濾器；伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3標準品（51.1μg/mL，ROMER公司）乙腈、甲醇、甲酸為色譜純試劑（天津市化學試劑研究所）；鹽酸、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀為優級純試劑（國藥集團化學試劑有限公司）；超純水；啤酒樣品購于超市。

附表1 梯度洗脫程序

附表2 3種伏馬毒素質譜參考條件

附表3 各目標化合物測定的工作曲線、定量下限和檢出限

附圖 伏馬毒素MRM圖

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 PBS緩沖溶液：稱取8.0g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.2g磷酸氫二鈉和0.2g磷酸二氫鉀溶于990mL水中，用鹽酸調節溶液pH值至7.0，加水定容至1.0L，混勻。

1.2.2 樣品前處理 稱取2g樣品于15mL聚丙烯離心管中，超聲15min，用乙腈/水溶液（50/50）定容至10mL，混勻，取上清液備用。

MultiSep? 211 Fum凈化柱先用5mL甲醇和5mL甲醇/水溶液（75/25）活化，取5mL上清液過柱，10mL PBS緩沖溶液淋洗免疫親和柱，3mL甲醇/乙酸（98/2，V/V）溶液分3次（每次1mL）洗脫免疫親和柱，收集的洗脫液于60℃下氮吹至干，準確加入1.0mL甲醇/0.1%甲酸水（75/25）溶液溶解殘留物，漩渦混勻，經0.22μm微孔濾膜過濾，待進樣。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC? HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm，美國Waters公司)；流速：0.30mL/min；流動相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈C：甲醇。柱溫：40℃；進樣量：10μL。流動相梯度洗脫程序見附表1。

1.2.4 質譜參考條件 電離源位電噴霧離子源，ESI+；毛細管電壓：4.0KV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：600L/H；錐孔反吹氣流量：30L/H；檢測方式：多離子反應監測MRM；伏馬毒素B1、B2、B3及其內標物的離子對及錐孔電壓、碰撞能量見附表2。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件優化 分別比較不同長度、不同粒徑的色譜柱，當采用Acquity UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)時，3種物質分離好，峰形尖銳，保留時間適中，能較好滿足定量檢測要求。為使3種伏馬毒素達到基線分離，采用常用的乙腈-水、甲醇-水和乙腈-甲醇-水，在水相中添加不同濃度的甲酸，通過比較分離效果，采用乙腈-甲醇-0.1%甲酸水體系，分離度和靈敏度都能達到最佳效果。經優化流速和流動相比例，選擇梯度洗脫，見附表1。優化條件下的MRM圖見附圖。

根據伏馬毒素的分子結構特征，選用ESI+電離模式。將3種伏馬毒素配置適當濃度溶液直接進質譜，分別對毛細管電壓、脫溶劑溫度、碰撞能量等條件進行了優化，確定3種伏馬毒素的母離子和子離子，見附表2。

2.2 方法的線性范圍與檢出限 試驗中發現樣品基質對伏馬毒素測定影響較小，因此采用單純的標準品配置標準曲線。以定性離子通道中信噪比（S/N）為3時樣品溶液中各毒素濃度為檢測限(LOD)，以定量離子通道中信噪比（S/N）為10時樣品中各毒素濃度為定量限（LOQ），見附表3。

2.3 方法回收率與精密度 對未檢測出伏馬毒素的啤酒樣品，分別添加5.0μg/kg、10μg/kg、50μg/kg3個低中高水平濃度的伏馬毒素混合標準溶液，每個水平進行6 次檢測。經測定F B1回收率在82.6%～89.1%之間，FB2回收率在84.7%～86.4%間，FB3回收率在87.2%～91.5%之間；相對標準偏差RSD均＜6.1%。

2.4 樣品測定 本文測定30份啤酒，其中2份中檢測到FB1，且含量分別是0.410μg/kg、0.347μg/kg，其他2種毒素均未檢出。

3 結論

本研究建立了檢測啤酒中伏馬毒素含量的液相色譜-串聯質譜法，樣品經乙腈提取，免疫親和柱凈化，用超高效液相色譜-串聯質譜法測定。實驗結果表明：該方法具有靈敏度高，分析時間短，節省流動相，環保高效，方法簡單、快速、高效等優點，為檢測啤酒中此類毒素提供了一種新的檢測方法，同時為其他品種酒類中伏馬毒素的檢測提供參考。