腫瘤抑素相關肽T42對人臍靜脈內皮細胞和人胃腺癌細胞的抑制作用

鄭州大學附屬洛陽中心醫院（471000）董瑞強 張丹鳳 孫廣榮

腫瘤抑素所處的位置為IV型膠原α3鏈的C端非膠原區，其可以會導致機體出現肺出血，以及腎小球腎炎。因此不能將其對人體進行直接應用[1]。本次研究的時間段為2016年1月～2016年6月，探討腫瘤抑素相關肽T42對人臍靜脈內皮細胞和人胃腺癌細胞的抑制作用，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 研究材料 本次研究所選用的觀察對象為細胞，分組的方式為隨機分組，開展的時間段為2016年1月～2016年6月，本次研究所采用的大腸桿菌來自SMELD公司，本次研究所采用的人臍靜脈內皮細胞是由我院樣本室自主保存，本次研究所采用的人胃腺癌中分化細胞株來自廣州生物研究所，本次研究所采用的T42表達載體的構建工作是由本次研究人員共同來完成。

1.2 研究方法 腫瘤抑素相關肽T42的表達與純化：于大腸桿菌菌株中，將T42質粒轉化進來，將單菌落進行挑選，將其置于LB培養基接種，培養基中含有氨芐青霉素，濃度為100mg/L，對培養基進行震蕩，保持溫度為37℃，第2d按照1∶50的比例，再次于LB培養基上接種，培養基含有氨芐青霉素，開始震蕩30min，保持溫度為37℃，將IPTG加入，濃度為0.5mmol/L。繼續進行培養，時間6h，保持溫度為28℃，之后開展離心，時間10min，速度為每分鐘5000轉，離心完成后，對菌體進行收集。于預冷的裂解緩沖液中將菌體重懸，超聲破菌后，離心，時間15min，速度每分鐘12000轉，提取上清液，注入幾丁質親和柱。

細胞增殖抑制實驗的方法選用MTT法進行，對人臍靜脈內皮細胞，以及人SGC-7901胃腺癌細胞進行培養基培養，使其發展為對數期，采用胰酶進行消化，開展接種，使其位于96孔板，保持溫度為37℃，培養24h后，分6組，分別加T21肽，T19肽，T42肽，T19+T21肽，以及順鉑，上述物質分別加不同濃度，對照組加磷酸鹽緩沖液，加液量同上述劑量相同，各濃度共包括6個復孔，終濃度為200，100，50，30，以及10mg/L。24h后，將MTT取20μL加入各孔中，孵育時間為4h，將孔內培養液吸取干凈，之后在采用二甲基亞砜進行添加，添加量為100μL，開始振蕩，時間為10min，對吸光度進行測定。

蘇木精-伊紅染色觀察細胞形態：取人臍靜脈內皮細胞，以及人SGC-7901胃腺癌細胞，兩種細胞的生長期應為對數生長期，接種于24板孔，24h后，將終濃度為40mg/L的T42肽加入各孔，對照組加入磷酸鹽緩沖液，24h后，將蓋玻片取出，進行處理，包括固定，漂洗，蘇木精-伊紅染色等，然后借助顯微鏡進行觀察。

細胞遷移抑制實驗：取人臍靜脈內皮細胞，以及人SGC-7901胃腺癌細胞，兩種細胞的生長期應為對數生長期，接種于24板孔，直至其生長覆蓋率超90%后，于孔板底部，采用移液器槍頭進行劃痕，形成無細胞區，寬度約4mm，反復采用磷酸緩沖液進行沖洗，之后采用新鮮培養基進行重新加入，各細胞分3組，T42肽組，T19+T21肽半量聯合組，以及對照組，各組設復孔3個，于24h后，48h后觀察其遷移能力。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。用±s來表示計量數據，行t檢驗；用[例數(%)]來表示計數資料，行X2檢驗；P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 T42肽對人臍靜脈內皮細胞和人SGC-7901胃腺癌細胞生長的影響 T42肽不僅會抑制人臍靜脈內皮細胞，同時也會抑制人SGC-7901胃腺癌細胞，同時這種抑制作用于劑量存在明顯的關系，前者的IC50為45mg/L，后者的IC50為51mg/L。如附表1、2所示。

附表1 人臍靜脈內皮細胞存活率（%）

附表2 人SGC-7901胃腺癌細胞存活率（%）

附表3 T42肽對兩種細胞遷移的抑制作用

2.2 T42肽對兩種細胞形態的影響 T42肽在產生作用達到24h之后，可以發現人臍靜脈內皮細胞和人胃腺癌細胞出現細胞凋亡現象，同時上述兩種細胞同周圍的細胞發生分離，出現了皺縮，細胞的形狀呈現為卵圓形或圓形。

2.3 T42肽對兩種細胞遷移的抑制作用 采用T42肽作用于兩種細胞，使其發揮作用達到24h或是達到48h，結果都會對人臍靜脈內皮細胞和人胃腺癌細胞的遷移產生明顯的抑制作用。同時這種抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量聯合使用差異并不明顯（P＞0.05）。如附表3。

3 討論

腫瘤抑素在對腫瘤細胞進行殺滅時，不會對人體的正常細胞造成破壞，因此其不具有毒副作用。腫瘤抑素的功能區包括兩個，因此也就賦予了其具有的雙重抗腫瘤作用[2]。具有更為強烈的腫瘤抑制作用。加之該類物質具有較高活性的抗血管作用，達到內皮抑素的10倍，因此在采用其對機體進行治療時，不需要大量用藥，小劑量即可。相應的將治療成本有效降低，更有利于臨床應用普及[3]。

腫瘤抑素發揮其具有的抗血管作用，主要是憑借其對內皮細胞增殖，管狀化，以及細胞蛋白合成起到抑制作用，本次研究所采用的原核載體，有效地表達了目的基因，表達出的融合蛋白，其在上清液中，占到菌體蛋白的含量超過40%，加之采用幾丁質親和層析柱，開展純化，因此結果更為可靠有效。本次研究結果顯示，T42肽不僅會抑制人臍靜脈內皮細胞，同時也會抑制人SGC-7901胃腺癌細胞，同時這種抑制作用與劑量存在明顯的關系，前者的IC50為45mg/L，后者的IC50為51mg/L。T42肽在產生作用達到24h之后，可以發現人臍靜脈內皮細胞和人胃腺癌細胞出現細胞凋亡現象，同時上述兩種細胞同周圍的細胞發生分離，出現了皺縮，細胞的形狀呈現為卵圓形或圓形。采用T42肽進行使用，使其發揮作用達到24h或是達到48h，都會對人臍靜脈內皮細胞和人胃腺癌細胞的遷移產生明顯的抑制作用。同時這種抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量聯合使用差異并不明顯（P ＞0.05）。證實了T42肽可對人臍靜脈內皮細胞和人SGC-7901胃腺癌細胞的生長和遷移起到抑制作用，對腫瘤細胞和內皮增殖發揮抑制作用，從而可能對血管生長具有抑制作用。