AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺組織中的表達及相關性研究

王若冰,葉思楊,李董董,張揚賀,張麗紅,孫千惠,申祥鳳,菅永平,王醫術*

(1.吉林大學 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.吉林大學臨床醫學專業)

AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺組織中的表達及相關性研究

王若冰1,2,葉思楊1,2,李董董1,張揚賀1,張麗紅1,孫千惠1,申祥鳳1,菅永平1,王醫術1*

(1.吉林大學 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.吉林大學臨床醫學專業)

目的檢測 AKT、乳酸脫氫酶(LDH)及非肌細胞肌球蛋白重鏈II型A亞型(NMHCIIA)磷酸化(S1943)在乳腺組織中的表達情況，探討其在乳腺癌發病機制中的作用及相關性。方法采用免疫組化技術檢測AKT、LDH及NMHCIIAp-S1943在25例乳腺增生組織、25例乳腺纖維腺瘤組織和35例乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況。結果AKT、LDH、NMHCIIAp-S1943在乳腺增生組織、乳腺纖維腺瘤組織和乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況均依次增高，即隨著乳腺組織惡性程度的增加表達增高；且AKT與LDH在乳腺組織中表達呈正相關(P<0.005)，LDH與NMHCIIA p-S1943在乳腺組織中表達呈正相關(P<0.005)。結論AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺組織癌變的發展過程中起著重要的作用，三者之間存在一定關系。

乳腺癌；AKT；LDH；NMHCIIA ；腫瘤微環境；免疫組化

(ChinJLabDiagn,2017,21:1687)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其死亡主要原因是轉移和復發[1]。腫瘤之所以能夠發生及轉移，腫瘤微環境起著關鍵作用[2]。微環境的產生離不開腫瘤細胞的糖代謝，有報道顯示，腫瘤無氧糖酵解中產生乳酸堆積和遠距離轉移的發生率之間存在著正相關關系。絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT，可通過對基因表達和酶活性的調節，促進糖酵解和乳酸的生成。非肌細胞肌球蛋白II(NMII)是細胞骨架的重要組成成分。NMII是由重鏈(NMHC)和輕鏈(NMLC)組成的，其中NMLC對NMHC起著穩定和調節作用，NMHC通過磷酸化活化調控細胞的運動。而乳酸對腫瘤細胞侵襲和轉移的調控是否與NMHCII有關，尚未見報道。本研究通過免疫組織化學方法觀察分析不同乳腺組織中AKT、乳酸的關鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)的表達情況，并分析它們與NMHCIIA可能的關系，研究三者在乳腺癌發生、發展中的作用。

1 材料和方法

1.1標本來源

篩選收集吉林大學基礎醫學院病理學系2010年1月至2016年7月乳腺活檢的85例病例作為研究對象，其中乳腺增生25例，乳腺纖維腺瘤25例，乳腺浸潤性導管癌35例。

1.2主要試劑

免疫組化SP試劑盒(福州邁新生物技術公司)，復合消化酶(天津灝陽公司)，DAB 顯色試劑盒(福州邁新生物技術公司)，兔抗人AKT2多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人LDH單克隆抗體(Abcam 公司)，兔抗人NMHCIIAp-S1943單克隆抗體(Cell Signaling technology,USA)。

1.3實驗方法

按免疫組化試劑盒說明書操作。采用 OLYMPUS DPT2 CCD 圖像采集照相，然后應用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對圖像進行定量分析并計算平均IOD值。

1.4統計方法

用SPSS 18.0統計軟件進行分析。

2 結果

2.1AKT、LDH及NMHCIIAp-S1943在乳腺組織中的表達情況

通過免疫組織化學染色觀察乳腺增生組織、乳腺纖維腺瘤及乳腺浸潤性導管癌中AKT、LDH和NMHCIIAp-S1943的表達情況，判定標準：AKT陽性表達為組織細胞胞漿/胞膜出現棕黃色顆粒，LDH陽性表達為組織細胞胞漿出現棕黃色顆粒。結果顯示，AKT在乳腺組織中均呈陽性表達，主要表達于增生細胞、瘤細胞，癌細胞的胞漿/胞膜中，在乳腺浸潤性導管癌中為強陽性表達，而在乳腺增生組織和乳腺纖維腺瘤中呈強弱不等的表達。LDH在乳腺組織中均呈陽性表達，主要表達于增生細胞、瘤細胞，癌細胞的胞漿中，但在乳腺浸潤性導管癌中為強陽性表達，而在乳腺增生組織和乳腺纖維腺瘤中呈強弱不等的表達。NMHCIIAp-S1943主要定位于胞膜、胞漿和(或)胞核中。在乳腺浸潤性導管癌中呈強陽性表達，在乳腺纖維腺瘤和乳腺增生組織中呈強弱不等的表達。

2.2AKT、LDH與NMHCIIAp-S1943的關系

在對乳腺增生，乳腺纖維腺瘤，乳腺浸潤性導管癌三類標本進行免疫組化染色后，通過Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析并計算平均IOD值，結果見表1。乳腺組織標本AKT、LDH的免疫組化染色結果平均IOD值，經Pearson相關性分析得出兩者的相關系數r=0.958,P<0.005，具有統計學意義。LDH、NMHCIIA的免疫組化染色結果平均IOD值，經Pearson相關性分析得出兩者相關系數r=0.927，P<0.005，具有統計學意義。

表1 各組別平均IOD值

3 討論

AKT又名蛋白激酶B，同其他AGC激酶一樣，受到上游的第二信使調節。同時，它還是重要的信號蛋白分子，是PI3K信號傳導通路重要的中心環節。AKT是細胞內、外信號傳導的重要節點。癌癥中磷酸化的AKT多呈持續地高度活化狀態，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結直腸癌和肺癌中均是如此[3,4]。高度活化的AKT可能會通過以下幾種方式參與腫瘤的發展過程：抑制細胞的凋亡與自噬，提高基因突變的速率，加速細胞增殖。其中AKT對腫瘤細胞能量代謝的調控起到最主要的作用，尤其是對腫瘤細胞的經典代謝方式即Warburg效應的影響[5,6]。

另外，在正常的快速增殖細胞如處于快速分裂狀態的胚胎細胞，也有糖酵解增強的現象[3]，這暗示著腫瘤細胞可能采用類似于胚胎細胞的某些生長策略來實現其快速增殖的目的。

腫瘤微環境不僅為腫瘤生長提供適宜條件，還是腫瘤與微環境相互作用的場所[7,8]。乳酸作為糖酵解的最終產物，也是一種微環境因子。乳酸化是實體腫瘤中普遍存在的現象。LDH的表達與腫瘤的分化增殖、細胞遷移及浸潤侵襲也有著密切的關聯。有文獻表明，腫瘤的酸性微環境與細胞骨架間存在著某些聯系[9,10]。非肌細胞肌球蛋白II是細胞骨架的重要組成成分。作為分子馬達蛋白家族中的一員，它不僅為細胞的運動提供動力，還參與細胞的各種生理活動，如細胞遷移與粘附、胞質分裂、囊泡分泌等。NMII是一個六聚體的結構，由重鏈(NMHC)和輕鏈(NMLC)組成，其中NMLC對NMHC起著穩定和調節作用，NMHC通過磷酸化活化調控細胞的運動。NMHCII可根據重鏈不同分為NMHCIIA，NMHCIIB和NMHCIIC三種亞型。我們課題組前期工作表明，在乳腺癌組織和乳腺癌MCF-7細胞中，均存在NMHCIIA和NMHCIIB兩個亞型，這兩種亞型在乳腺癌細胞的遷移、侵襲等起始階段，均起著重要的調控作用，且NMHCIIA影響NMHCIIB的表達。已有研究表明非肌細胞肌球蛋白重鏈IIA磷酸化(S1943)可引起乳腺癌的浸潤、轉移[11]。而乳酸對腫瘤細胞侵襲和轉移的調控是否與NMHCIIA有關，尚未見報道。

我們篩選收集吉林大學白求恩醫學院病理學系2010年1月至2016年7月乳腺活檢的85例病例作為研究對象，在乳腺增生、乳腺纖維腺瘤、乳腺浸潤性導管癌三類標本中，對AKT、乳酸關鍵酶LDH及NMHCIIAp-S1943進行免疫組化染色后，觀察統計發現：AKT、 LDH、NMHCIIA p-S1943均定位于增生細胞、瘤細胞，癌細胞的胞漿/胞膜中，且乳腺浸潤性導管癌中AKT、LDH、NMHCIIA p-S1943表達量最高，乳腺纖維腺瘤次之，乳腺增生組織表達量最少，且組間比較差異有統計學意義，說明AKT、LDH、NMHCIIAp-S1943可能在乳腺組織癌變的過程中發揮重要作用。

乳腺組織標本AKT、LDH的免疫組化染色結果平均IOD值，經Pearson相關性分析得出兩者的相關系數r=0.958，P<0.005，具有統計學意義，乳腺組織中AKT和LDH表達成正相關。LDH、NMHCIIA p-S1943的免疫組化染色結果平均IOD值，經Pearson相關性分析得出兩者相關系數r=0.927，P<0.005，具有統計學意義，LDH和NMHCIIAp-S1943表達成正相關。 由此發現，三者間應發揮著一定的協同作用，共同調節乳腺癌的浸潤和轉移。

[1]鄭 瑩,吳春曉,張敏璐.乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征[J].中國癌癥雜志,2013,23(8):561.

[2]Hugo H J,Kokkinos M I,Blick T,et al.Defining the E-cadherin repressor interactome in epithelial-mesenchymal transition:the PMC42 model as a case study.[J].Cells Tissues Organs,2010,193(1-2):23.

[3]Vander Heiden MG,Cantley LC,Thompson CB.Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation[J].Science,2009,324(5930):1029.

[4]Kamarajugadda S,Stemboroski L,Cai Q,et al.Glucose oxidation modulates anoikis and tumor metastasis[J].Molecular and cellular biology,2012,32(10):1893.

[5]Dummler B,Hemmings B A.Physiological roles of PKB/Akt isoforms in development and disease[J].Biochemical Society Transactions,2007,35(Pt 2):231.

[6]Toker A,Marmiroli S.Signaling Specificity in the Akt Pathway in Biology and Disease[J].Advances in Biological Regulation,2014,55:28.

[7]Mantovani A,Romero P,Palucka AK,et al.Tumour immunity:effector response to tumour and role of the microenvironment[J].Lancet,2008,371(9614):771.

[8]Witz IP.Yin-yang activities and vicious cycles in the tumor microenvironment[J].Cancer Research,2008,68(1):9.

[9]Pope BJ,Zierler-Gould KM,Kuhne R,et al.Solution structure of human cofilin:actin binding,pH sensitivity,and relationship to actin-depolymerizing factor[J].The Journal of Biological Chemistry,2004,279(6):4840.

[10]McLachlan GD,Cahill SM,Girvin ME,et al.Acid-induced equilibrium folding intermediate of human platelet profiling[J].Biochemistry,2007,46(23):6931.

[11]Dulyaninova NG,Malashkevich VN,Almo SC,et al.Regulation of myosin-IIA assembly and Mts1 binding by heavy chain phosphorylation[J].Biochemistry,2005,44(18):6867.

TheexpressionandcorrelationofAKT,LDHandNMHCIIAinbreasttissue

WANGRuo-bing,YESi-yang,LIDong-dong,etal.

(KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo examine the expression and correlation of AKT, LDH and NMHCIIAp-S1943 in breast tissue.MethodsThe expression of AKT,LDH and NMHCIIAp-S1943 in 25 cases of cyclomastopathy,25 cases of breast fibroadenoma and 35 cases of invasive ductal carcinoma of the breast (IDCB) was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of AKT in cyclomastopathy,breast fibroadenoma and invasive ductal carcinoma of the breast rises in turn.Namely,as the degree of malignancy increases,the expression of AKT increases.Similar results were obtained by the expression analysis of LDH and NMHCIIAp-S1943.In breast tissue,the expression of AKT is positively correlative with that of LDH(P<0.005).The expression of LDH is also positively correlative with that of NMHCIIAp-S1943(P<0.005).ConclusionAKT,LDH and NMHCIIAp-S1943 respectively play a significant part in cancerous progress of breast tissue,and there is correlation between AKT,LDH and NMHCIIA p-S1943.

breast cancer;AKT;LDH;NMHCIIA;tumor microenvironment;immunohistochemistry

R737.9

A

2016-11-14)

吉林省科技廳國際合作處項目(20160414023GH);吉林省科技廳重點科技攻關項目(20150204066SF)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1687-03