吉林省耐多藥結核分枝桿菌rpoB及katG基因突變特征分析

張煒煜，楊修軍，王 慧，張立夫，李可維

(吉林省疾病預防控制中心， 吉林 長春130062)

吉林省耐多藥結核分枝桿菌rpoB及katG基因突變特征分析

張煒煜，楊修軍*，王 慧，張立夫，李可維

(吉林省疾病預防控制中心， 吉林 長春130062)

目的分析吉林省耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株rpoB、katG基因突變特點，為建立本省快速耐多藥檢測方法提供參考。方法對吉林省耐多藥結核分枝桿菌菌株擴增rpoB、katG基因測序后比對分析。結果耐多藥結核分枝桿菌rpoB、katG基因的突變率分別為 83.53 %和70.6%，突變類型包括點突變、聯合突變和缺失。在rpoB基因中，82.30 %突變發生在RRDR區域，最常見突變位點為rpoB 531、rpoB 526、rpoB 516。KatG基因突變率為70.6 %，最常見突變位點為katG315，占所有突變的68.55%。結論吉林省耐多藥結核分枝桿菌最常見突變位點為 rpoB 531、 rpoB 526、rpoB 516和katG 315。

結核分枝桿菌；耐多藥;rpoB;katG；基因突變

(ChinJLabDiagn,2017,21:1731)

耐多藥結核病(MDR-TB)的發生與傳播是當前結核病疫情嚴重的主要原因之一[1]。截止到2015年，在估計的58萬符合耐多藥結核病治療條件的新發病例中，只有12.5萬(20%)登記接受治療[2]。耐多藥結核病的出現，對全球消滅結核病的目標和各國公共衛生提出了新的挑戰[2]。抗結核藥物耐藥性監測已經成為控制耐多藥結核病流行的有效手段。已有研究表明,耐多藥結核病的產生與耐藥基因(rpoB和katG)突變密切相關[3-6]。不同地理區域的結核分枝桿菌的遺傳進化過程受到環境影響,其耐藥基因突變類型和頻率存在較大差異[6-8],研究吉林省MDR-TB耐藥相關基因突變特征,為建立快速、準確和特異的耐多藥結核病診斷技術提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1菌株

500株耐多藥結核分枝桿菌菌株來源于2013-2015年吉林省4個地區臨床分離株(長春地區298株、延邊地區86、吉林地區65株、通化地區51株)，80株藥物敏感菌株來源于吉林省疾病預防控制中心結核參比實驗室菌株庫，實驗對照菌株為中國疾病預防控制中心結核參比實驗室饋贈的標準菌株(H37Rv)。

1.2方法

1.2.1分離菌株藥物敏感性試驗 采用比例法進行藥物敏感性實驗[9]，包括異煙肼(INH)、利福平(REF)、卡那霉素(Km)、氧氟沙星(Ofx)。含藥培養基內藥物終濃度分別為異煙肼0.2 μg /mL、利福平 40 .0 μg/mL、氧氟沙星 2.0 μg/mL 和卡那霉素30 μg/mL，統一購自珠海貝索公司，且在有效期內使用。

1.2.2結核分枝桿菌DNA模板的制備 取改良羅氏培養基上培養、生長良好的的克隆菌1標準環，加入到200 μl TE的EP管中，85℃金屬浴30 min滅活，然后100℃金屬浴10 min，冰浴5 min，13 000 rmp/min 離心10 min，取上清液轉移至新管中即為DNA模板，-20℃保存待用。

1.2.3耐藥基因擴增及測序 從http：//www.ncbi.nlm.nih.gov的Genbank中獲得結核分枝桿菌(H37Rv)rpoB、katG基因標準序列，采用Primer 5.0設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。擴增的基因片段送生工生物工程(上海)股份有限公司測序分析。

表1 PCR 引物序列

1.2.4測序結果比對 測序結果與標準菌株H37Rv的基因序列進行比對，確定基因突變位點。

1.3統計學方法

實驗結果采用MEGA 6.06軟件進行分析。

2 結果

2.1耐藥基因序列比對結果

實驗對照菌株的rpoB、katG基因測序結果與Genbank公布的結核分枝桿菌(H37Rv)耐藥基因標準序列完全一致，表明本次耐藥基因擴增目標序列結果準確。MDR-TB菌株耐藥基因測序結果采用MEGA6.06軟件分析，與標準菌株H37Rv的rpoB、katG基因序列進行多序列分析，分析各菌株耐藥基因突變位點及突變類型。

2.2MDR-TB菌株rpoB基因突變特征

500株MDR-TB菌株中，486株獲得rpoB基因測序結果。測序結果與rpoB基因(基因編號888164)序列比對，突變率為83.53%(406/486)。80株藥物敏感菌株未檢測到rpoB基因突變。406株rpoB基因突變菌株共發現50種基因突變類型(包括：堿基突變、缺失和插入)。其中，單堿基突變、雙堿基突變、多堿基突變、堿基缺失的發生率分別為69.55%(338/486)、10.49%(51/486)、1.85%(9/486)、1.65%(8/486)。在堿基突變統計中發現，rpoB基因突變主要發生在507-533位的81個堿基區域內，占 82.30 %(400/486),突變發生在前3順位的是rpoB 531(179/486,36.83%)、rpoB 526(122/486,25.10%)、rpoB 516(48/486,9.88%)，具體情況見表2。13株MDR-TB菌株單位點堿基突變位于RRDR決定區外，為386、389、403、430、457、480、490；1株菌株發生雙堿基突變rpoB403(ATC→GTC)聯合rpoB424(CAC→CGC)，該雙突變位點尚未見文獻報道。國內外的研究極少發現耐利福平結核分枝桿菌缺失和插入突變,本研究中3例MDR-TB菌株中檢測出堿基缺失，其中2株菌株缺失位點為516-520位點，1株菌株位點缺失為rpoB 519，2株MDR-TB菌株插入序列為rpoB 514，均位于RRDR決定區內。另外，80株MDR-TB菌株未檢測到rpoB基因突變，可能存在結核分枝桿菌耐RFP機制的新說法。

表2 MDR-TB菌株rpoB基因突變特征檢測

aIncluding two isolates having synonymous mutations at 533 (CTG→GCC ) or 442(ACC→ACT) meanwhile.

2.3MDR-TB菌株katG基因突變特征

本研究發現，353株菌株檢測到katG基因突變，共發現堿基點突變、聯合突變和堿基缺失等26種基因突變類型，具體見表3。katG基因總突變率為70.6%(353/500)，katG315位點突變占所有位點突變的68.55%(242/353)。katG315突變存在5種突變類型，發生AGC→ACC突變的菌株較多，數目為204株，比例占發生katG315位點突變菌株的84.30 %(204/242)。此外，8株發生了同義突變，分別在327位點 (AAG→AAA) 和 345位點 (AAC→AAA)。

2.4rpoB和katG基因相關性

500株MDR-TB菌株檢測到rpoB 突變的406株，未檢測到突變的為94株。結果顯示，406株rpoB 突變菌株中292株發生katG突變，主要突變位點為rpoB531和katG 315。MDR-TB菌株中rpoB 基因突變與katG基因突變具有相關性，具有統計學意義(χ2=16.05，P<0.01)。

表3 MDR-TB菌株katG基因突變特征檢測

bIncluding two isolates having synonymous mutations at 327 (AAG→AAA) or 345 (AAC→AAA) meanwhile.

3 討論

已有研究表明，利福平耐藥結核分枝桿菌主要與編碼細菌RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因突變有關，超過90%突變位于507-533位密碼子的利福平耐藥決定區(RRDR),另有5%的突變發生在熱點區域外[6]。本研究中，rpoB基因總突變率為83.53%(406/486)，共發現堿基突變、缺失，插入等50種基因突變類型。其中，單位點堿基突變、雙位點堿基突變、多位點堿基突變、堿基缺失的發生率分別為69.55%(338/486)、10.49%(51/486)、1.85%(9/486)、1.65%(8/486)。RRDR區域內rpoB基因突變率為71.6 %(348/486)，突變發生在前3順位的是rpoB 531(36.83 %)、rpoB 526(25.10 %)、rpoB 516(9.88 %)。有研究表明[10]，rpoB基因531位點上的Ser是利福平作用于結核分支桿菌的最關鍵的靶點，該位點發生突變將直接導致利福平耐藥的產生。rpoB 526位點在不同地理位置呈現高低不同的突變頻率[11],本研究526位點的突變率為22.02 %(107/486),存在7種點突變類型和5種聯合突變類型，進一步提示吉林省MDR-TB菌株耐藥突變模式與其他區域間存在不同的差異性。13株MDR-TB菌株單位點堿基突變位于RRDR決定區外，為386、389、403、430、457、480、490；1株菌株發生雙堿基突變rpoB403(ATC→GTC)聯合rpoB424(CAC→CGC)，該雙突變位點尚未見文獻報道。本研究中，有 16.46%(80/486)菌株未檢測到rpoB基因突變，表明除了rpoB基因突變外，尚存在其他利福平耐藥機制。

Zhang[12]等最早研究MTB的耐藥機制，提示由于katG基因的完全缺失造成了過氧化氫酶-過氧化物酶的活性喪失從而導致MTB對INH的高耐藥。本研究中異煙肼耐藥基因katG突變位點，氨基酸變化與Mekonnen等[13-15]的研究結果一致。katG基因突變導致異煙肼耐藥的原因主要是：315位點的Ser轉變成Thr，使得katG編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性下降，導致異煙肼無法活化異煙酸，致使結核分支桿菌產生耐藥性。本研究顯示，吉林省MDR-TB菌株katG基因總突變率為70.6%(353/500)，katG基因突變高度集中于315位點，占68.55%(242/353)。katG315突變存在5種突變類型，發生AGC→ACC突變的菌株較多，數目為204株(84.30 %)。

吉林省MDR-TB菌株rpoB基因突變類型較多，其中rpoB基因突變最多的為rpoB 531、526、516位點，其突變位點具有多態性；katG基因突變高度集中于315位點。同時，本研究中292株同時發生rpoB和katG基因突變，主要突變位點為rpoB531和katG 315。通過對吉林省MDR-TB菌株耐藥基因突變特征分析，說明rpoB 基因81bp核心區突變和katG 315突變是MDR-TB菌株耐藥的主要分子機制。

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MutationsofrpoBandkatGdruggenesinmultidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolatesfromJilinprovince

ZHANGWei-yu,YANGXiu-jun,WANGHui,etal.

(JilinCenterforDiseaseControlandPrevention，Changchun130062，China)

ObjectiveTo analyze the mutations of rpoB and katG gene in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis(MDR-TB)isolates in Jilin Province,so as to provide reference for the establishment of rapid multi-drug resistance detection methods.MethodsComparison and analysis of rpoB and katG gene sequences of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in Jilin Province.ResultsThe mutation rates of rpoB and katG genes in MDR-TB were 83.53% and 70.6%.The mutation types included point mutation,combined mutation and deletion.In the rpoB gene,82.30% mutations occurred in the RRDR region,and the most common mutation sites were rpoB 531,rpoB 526,and rpoB 516.In the katG gene,68.55% strains mutation occurred in katG315.ConclusionThe most common mutation sites of MDR-TB in Jilin were rpoB 531、 rpoB 526、rpoB 516、katG 315.

Mycobacterium tuberculosis;multidrug-resistance;rpoB;katG;Gene mutation

R52

A

2016-05-29)

《中國實驗診斷學》雜志社聲明

吉林省衛生計生委科研基金項目(2015ZC037)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1731-05

張煒煜(1982-),女，碩士，主管技師，從事病原微生物分子流行病學研究。

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