馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀相關(guān)QTL在兩個(gè)群體中的驗(yàn)證

韋國(guó)建，管云雁，劉文廣，林堅(jiān)士，何毛賢

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀相關(guān)QTL在兩個(gè)群體中的驗(yàn)證

韋國(guó)建1，2，管云雁1，劉文廣1，林堅(jiān)士1，何毛賢1

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

對(duì)兩個(gè)通過遺傳圖譜構(gòu)建定位的馬氏珠母貝（Pinctada ucata）生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL在兩個(gè)不同群體中進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示：QTL471489在深圳群體中與殼高、殼寬顯著相關(guān)（P<0.05），其CT基因型個(gè)體的殼高、殼寬和體質(zhì)量顯著大于CC基因型，CT為優(yōu)勢(shì)基因型；而在雜交群體中該QTL與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著（P>0.05），但CT基因型的生長(zhǎng)性狀值仍最大。QTL410206在深圳群體中與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著（P>0.05），而在雜交群體中該QTL與殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量顯著相關(guān)（P<0.05），AA為優(yōu)勢(shì)基因型。基于這兩個(gè)QTL在這2個(gè)群體中分別構(gòu)建二倍型，發(fā)現(xiàn)在深圳群體中C1（CTAT）型和雜交群體中D1（CTAA）、D2（TTAA）、D3（CCAT）、D4（TTAT）、D5（CTAA）型對(duì)馬氏珠母貝的生長(zhǎng)最為有利，可作為優(yōu)選的基因型組合。

馬氏珠母貝；數(shù)量性狀位點(diǎn)；生長(zhǎng)性狀；驗(yàn)證

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的大多數(shù)經(jīng)濟(jì)性狀不僅由多個(gè)基因控制，而且容易受環(huán)境等因素的影響，如體質(zhì)量、體長(zhǎng)和生長(zhǎng)率等，它們都是數(shù)量性狀（Gje原drem et al，2010）。挖掘數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantita原tive trait locus，QTL）的最終目的就是利用與目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過對(duì)分子標(biāo)記基因型的檢測(cè)，就能獲知目標(biāo)基因的選擇，發(fā)展分子標(biāo)記輔助選擇育種（Molecular marker-assistedse原lection，MAS），即實(shí)現(xiàn)基因型選擇育種，從而促進(jìn)對(duì)性狀的遺傳改良（Naish et al，2008）。MAS與傳統(tǒng)的育種方法相比，它可以大大提高選擇的效率和可靠性（Ozaki et al，2012），因此已成為遺傳育種研究的主要發(fā)展方向。盡管國(guó)內(nèi)外在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的遺傳作圖、QTL定位以及性狀關(guān)聯(lián)分析方面取得了較大的進(jìn)展，但是基于QTL結(jié)果進(jìn)行指導(dǎo)育種的研究還很少，其主要原因就是定位到的QTL很少被鑒定，這些QTL的真實(shí)性和通用性還不清楚，因而限制了其應(yīng)用。因此對(duì)QTL定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和鑒定是實(shí)施MAS的重要前提（Yue，2014）。目前僅在牙鲆（Paralichthys olivaceus）（Fuji et al，2007，Wang et al，2014）、大西洋鮭魚（Salmo salar）（Moen et al，2009;Tsai et al，2015）、虹鱒（On原corhynchus mykiss）（Wringe et al，2010;Baerwald et al，2011;Vallejo et al，2014）、尖吻鱸（Lates calcar原ifer）（Wang et al，2008）、大黃魚（Larimichthyscrocea）（劉賢德等，2013）、鏡鯉（Cyprinus carpio）（魯翠云等，2012）等少數(shù)魚類的抗病和生長(zhǎng)標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證，并且MAS已經(jīng)成功應(yīng)用于牙鲆抗淋巴囊腫病（LD）（Fuji et al，2007）、大西洋鮭魚抗傳染性胰臟壞死癥（IPN）（Moen et al，2009）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的早期性別鑒定（Chen et al，2008）、鏡鯉優(yōu)良性狀的培育（孫效文等，2009）等。在海洋貝類中，還極少見有對(duì)QTL定位結(jié)果進(jìn)行鑒定和應(yīng)用的報(bào)道。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata）是世界上重要的海水珍珠生產(chǎn)貝類，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物一樣，目前馬氏珠母貝的育種方法主要是基于表型的傳統(tǒng)選擇，為了提高其育種效率，有必要開展基因型選擇育種研究。最近，Shi等（2014）利用2b-RAD測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了馬氏珠母貝高密度遺傳連鎖圖譜，定位到6個(gè)與殼長(zhǎng)、鉸合線長(zhǎng)、體質(zhì)量、珍珠層厚度相關(guān)的QTL。Li等（2014）利用RAD測(cè)序技術(shù)獲得了馬氏珠母貝1373個(gè)SNP標(biāo)記，構(gòu)建其高密度遺傳連鎖圖譜，定位到與殼高、殼長(zhǎng)、殼寬、絞合線等7個(gè)生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL，其中定位到QTL471489與軟體部重顯著相關(guān)，QTL410206與殼長(zhǎng)、總重和軟體部重顯著相關(guān)。但是這些QTL定位結(jié)果都是基于單個(gè)家系構(gòu)建遺傳連鎖圖譜獲得的，而且樣本量小，導(dǎo)致獲得的QTL結(jié)果可能并不適用于其他家系或群體。鑒于育種的繁殖群體多為來源于大樣本隨機(jī)群體，因此將獲得的QTL結(jié)果在不同遺傳背景的群體中進(jìn)行驗(yàn)證十分必要。目前，僅有少數(shù)QTL標(biāo)記被驗(yàn)證（韋國(guó)建等，2015）。本研究用馬氏珠母貝兩個(gè)不同遺傳背景的群體對(duì)其中的兩個(gè)QTL標(biāo)記（471489和410206）進(jìn)行驗(yàn)證（Li et al，2014），評(píng)估QTL標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，為開展基于馬氏珠母貝QTL結(jié)果的分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)群體

實(shí)驗(yàn)所用的驗(yàn)證分析群體為深圳群體和1個(gè)雜交群體（其親本為深圳群體和湛江養(yǎng)殖群體）。其中深圳養(yǎng)殖群體為8月齡貝，雜交群體為2月齡貝，均養(yǎng)殖于深圳大鵬澳海區(qū)。從深圳養(yǎng)殖群體和雜交群體中分別隨機(jī)抽樣170只和118只。每只貝的殼高、殼長(zhǎng)和殼寬用游標(biāo)卡尺測(cè)量，精確到0.01mm；體質(zhì)量用電子天平稱量，精確到0.01 g。測(cè)量完成后活體取樣，即從活體的貝中取下一小塊的鰓組織置于90%乙醇，于-20益保存。

1.2 基因組DNA的提取和基因分型

使用DNA提取試劑盒（Hipure Universal DNA Kit）提取鰓組織的基因組DNA，相關(guān)操作參照試劑盒說明書。提取DNA后，于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性；并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。提取的DNA于–20益保存。

將獲得的QTL標(biāo)記（471489和410206）所在的短序列作為源序列（Li et al，2014），在已公布的馬氏珠母貝基因組草圖（http：//marinegenomics.oist.jp/）和本實(shí)驗(yàn)已有的馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，找出與之匹配的序列。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）對(duì)QTL標(biāo)記SNP進(jìn)行基因分型，由北京華諾時(shí)代科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用PIC_CALC軟件計(jì)算QTL標(biāo)記的多態(tài)信息含量（polymorphism content information，PIC）。利用PopGene1.3軟件計(jì)算QTL在群體中期望雜合度（expected heterozygosity，He）和觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho），并進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）的檢驗(yàn)。利用SPSS19.0軟件中的一般線性模型（GLM）進(jìn)行標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析，模型如下：Yij=怎+Gior Di+eij，其中Yij表示基因型為i的第j個(gè)個(gè)體的指標(biāo)，怎表示群體均值，Gi表示第i種基因型的效應(yīng)，Di表示第i種二倍型的效應(yīng)，eij表示隨機(jī)誤差變量；基因型對(duì)應(yīng)性狀均值之間的差異用Duancan進(jìn)行多重比較分析，顯著性差異設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 QTL標(biāo)記的遺傳參數(shù)

利用MALDI-TOF-MS法對(duì)深圳群體和雜交群體個(gè)體的QTL標(biāo)記SNP進(jìn)行了基因分型，將獲得QTL471489和410206標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)，利用Popgene1.3軟件和PIC_CALC軟件分析這兩個(gè)群體的2個(gè)QTL標(biāo)記SNP的遺傳多樣性參數(shù)（見表1）。結(jié)果表明，QTL471489和410206標(biāo)記在深圳群體中Ho和He分布區(qū)間分別為0.195 2～0.512 8和0.249 8～0.440 5，在雜交群體中Ho和He分布區(qū)間分別為0.283 1～0.613 5和0.252 4～0.500 1。根據(jù)中度多態(tài)性原則0.25

表1 QTL標(biāo)記的遺傳參數(shù)

2.2 QTL標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

生長(zhǎng)性狀分析表明，深圳群體和雜交群體的殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重均符合正態(tài)分布。經(jīng)SPSS19.0軟件的一般線性模型分析（GLM），QTL471489標(biāo)記在深圳群體中與殼高、殼寬顯著相關(guān)（P<0.05）（表2），基因型多重比較分析發(fā)現(xiàn)，CT基因型的個(gè)體在殼高、殼寬和體質(zhì)量顯著大于TT基因型，分別高出4.90%、5.13%和10.22%，CT為優(yōu)勢(shì)基因型（表3）。而在雜交群體中該QTL與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著（P>0.05）（表2），但是經(jīng)過不同基因型多重比較分析發(fā)現(xiàn)，CT基因型個(gè)體的生長(zhǎng)性狀均值仍最大，CT基因型的個(gè)體在殼寬顯著大于CC基因型（表3）。

經(jīng)過GLM模型分析，結(jié)果表明QTL410206標(biāo)記在雜交群體中與殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量顯著相關(guān)（P<0.05）（表2）；AA、AT基因型個(gè)體的殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量顯著高于TT基因，AA和AT基因型的生長(zhǎng)性狀值沒有顯著性差異，且AA基因型的生長(zhǎng)性狀值最大，AA為優(yōu)勢(shì)基因型，AA基因型個(gè)體在殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量比TT基因型高出8.88%、9.70%、8.29%和27.30%（表3）。而在深圳群體中該QTL與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著（P>0.05），AT基因型個(gè)體的生長(zhǎng)性狀值大于TT基因型。

表2 馬氏珠母貝QTL標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的GLM分析

表3 馬氏珠母貝2個(gè)QTL標(biāo)記不同基因型多重比較

2.3 QTL標(biāo)記SNP二倍型構(gòu)建及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

為了進(jìn)一步研究這兩個(gè)QTL標(biāo)記SNP與生長(zhǎng)性狀的作用，基于這兩個(gè)QTL在這兩個(gè)群體分別構(gòu)建二倍型。經(jīng)過SPSS19.0軟件的GLM分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)QTL標(biāo)記在這兩個(gè)群體中不存在交互作用（P>0.05）。但不同基因型在生長(zhǎng)性狀上差異顯著，通過基因型多重比較分析發(fā)現(xiàn)，在深圳群體中二倍型C1（CTAT）個(gè)體在殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量顯著高于C6（TTAT）（P<0.05）；在雜交群體中二倍型D1（CTAA）、D2（TTAA）、D3（CCAT）、D4（TTAT）、D5（CTAA）個(gè)體在殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量顯著大于二倍型D7（TTTT）、D8（CCTT）（P<0.05），二倍型D1、D2、D3、D4和D5的生長(zhǎng)性狀值沒有顯著差異（P>0.05）（表4）。

表4 QTL標(biāo)記SNP二倍型與馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

Andrew（2010）認(rèn)為在一個(gè)理想的群體中各個(gè)等位基因應(yīng)當(dāng)是處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，基因型的分布頻率是穩(wěn)定的，而且其雜合度之間的差異不顯著。本研究中字2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QTL471489標(biāo)記在深圳群體和雜交群體中顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。分析原因主要是由于人工選擇和非隨機(jī)交配等因素導(dǎo)致的（Waples et al，2015;Baird et al，2015）。QTL471489標(biāo)記SNP的C等位基因頻率在深圳群體為51.83%，而在雜交群體中的頻率只有25.85%，這可能是由于人工選擇育種造成的（Sun et al，2010）。

研究表明，QTL在不同的遺傳背景、不同的養(yǎng)殖環(huán)境以及不同的發(fā)育時(shí)期中驗(yàn)證應(yīng)該有不完全相同的結(jié)果。Baerwald等（2011）在虹鱒魚（On原corhynchus mykiss）中定位到與眩暈癥緊密連鎖的QTL，在大樣本的實(shí)驗(yàn)群體和驗(yàn)證家系中，獲得了一個(gè)共同QTL區(qū)間位于染色體Omy9，家系間可解釋的表型差異在50～86%間。Wang等（2008）用兩個(gè)不同遺傳背景的家系對(duì)尖吻鱸（Lates calcarifer）生長(zhǎng)性狀QTL進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)連鎖群LG2上的QTL標(biāo)記Lca371在兩個(gè)家系中與體重具有顯著的相關(guān)性，而其他QTL僅在一個(gè)家系表現(xiàn)出與性狀的相關(guān)性。Laghari等（2013）定位到與鯉魚（Cyprinus carpio）3個(gè)不同階段體重相關(guān)的QTL，在第6連鎖群上的1個(gè)QTL與3個(gè)階段的體重都相關(guān)的QTL，而不同階段也有特異的QTL存在。在本研究中，用兩個(gè)不同遺傳背景的馬氏珠母貝群體對(duì)QTL471489和410206標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)QTL471489標(biāo)記在深圳群體中與殼高、殼寬顯著相關(guān)，CT為優(yōu)勢(shì)基因型；在雜交群體中與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著，但CT基因型仍是生長(zhǎng)性狀值最大。QTL410206在雜交群體中與殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和體質(zhì)量顯著相關(guān)，而在深圳群體中與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著，這可能是由于AA基因型頻率過低，導(dǎo)致關(guān)聯(lián)分析結(jié)果被低估或高估（Ferraz et al，2009）。這兩個(gè)QTL標(biāo)記在兩個(gè)群體中驗(yàn)證的結(jié)果不一樣的原因可能是由于不同遺傳背景下QTL的等位基因頻率不一樣以及QTL間上位性效應(yīng)的影響（Frankel et al，1996）。Mackay（2014）在用果蠅（Drosophila melanogaster）表型性狀與基因間的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)上位性效應(yīng)對(duì)性狀表型值具有重要的作用。本研究用到兩個(gè)群體處于不同的發(fā)育階段，也會(huì)影響QTL在群體中驗(yàn)證的結(jié)果。孫效文等（2009）認(rèn)為同一物種但具有不同遺傳背景的群體或家系應(yīng)有不完全相同的QTL結(jié)果。因此，從已有的研究和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，影響QTL驗(yàn)證結(jié)果的因素是很多的、也很復(fù)雜，如遺傳背景、發(fā)育階段、群體數(shù)量、標(biāo)記間的互作等等，要想篩選到一個(gè)能廣泛應(yīng)用的關(guān)聯(lián)QTL標(biāo)記，需進(jìn)行大量的驗(yàn)證工作。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，這兩個(gè)QTL標(biāo)記均與多個(gè)生長(zhǎng)性狀相關(guān)，同時(shí)這兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)又與同一生長(zhǎng)性狀相關(guān)，表現(xiàn)出一因多效或多因一效的現(xiàn)象，說明這些生長(zhǎng)性狀可能是由一個(gè)以上的QTL所控制的，該現(xiàn)象也符合QTL的定義（Liu et al，2004）。Li等（2014）定位到QTL471489標(biāo)記與軟體部質(zhì)量顯著相關(guān)，QTL410206標(biāo)記與殼長(zhǎng)、體質(zhì)量和軟體部質(zhì)量顯著相關(guān)。雖然有一些性狀指標(biāo)在該研究中沒有檢測(cè)，但在本研究中顯著關(guān)聯(lián)的性狀仍與這篇文獻(xiàn)的報(bào)道存在一定的差異。這是因?yàn)檫@些定位到的QTL一般是通過特定的小樣本量家系作圖獲得的，獲得的QTL結(jié)果可能不適合用于另外一個(gè)家系或群體?？梢姡瑢?duì)QTL定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證十分必要。

單獨(dú)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行性狀的關(guān)聯(lián)分析提供的信息往往是有限的。不同SNPs之間存在相互作用，因而通過2個(gè)或2個(gè)以上的SNP位點(diǎn)基因型組合可以提供更豐富的遺傳信息來彌補(bǔ)單獨(dú)SNP的缺陷（He et al，2008;He et al，2012）。Cong等（2014）的研究發(fā)現(xiàn)，太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）IRR基因上的2個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建的二倍型D3（GGTT）的生長(zhǎng)性狀表型值比其他二倍型大，對(duì)太平洋牡蠣的生長(zhǎng)最為有利。在本研究中，基于這兩個(gè)QTL標(biāo)記在深圳群體和雜交群體中構(gòu)建二倍型，發(fā)現(xiàn)在深圳群體中二倍型C1（CTAT）對(duì)馬氏珠母貝生長(zhǎng)最為有利，可作為優(yōu)選的基因型組合；在雜交群體中二倍型D7（TTTT）、D8（CCTT）顯著小于D1（CTAA）、D2（TTAA）、D3（CCAT)、D4（TTAT）和D5（CTAA）型，在選育過程中可以避免選擇D7、D8型。這兩個(gè)QTL的相互作用需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

致謝：本實(shí)驗(yàn)使用的馬氏珠母貝材料在中國(guó)科學(xué)院大亞灣海洋生物綜合試驗(yàn)站養(yǎng)殖培育。

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Verification of QTL associated with growth traits in two populations of Pearl oyster Pinctada fucata

WEI Guo-jian1,2,GUAN Yun-yan1,LIU Wen-guang1,LIN Jian-shi1,HE Mao-xian1

(1.CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology,Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology,South China SeaInstitute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

Quantitative trait loci(QTL)affecting growth traits have been mapped in genetic map of Pinctadafucata.In this study,two of these QTL were verified in two populations with the different genetic backgrounds.The results showed that the QTL471489 was significantly associated with shell height and shell width in Shenzhen population(P<0.05),and oysters with genotype CT were bigger than those with the genotype TT in shell height,shell width and body mass,CT was the superior genotype.However,it was not significantly associated with growth traits in cross-population(P>0.05),and CT was still be the genotype with the maximal average of growth traits.QTL410206 was not significantly associated with growth traits in Shenzhen population(P>0.05),but it was significantly associated with shell height,shell length,shell width and body mass in cross-population(P<0.05),and AA was the superior genotype.Diplotypes were constructed based on the two QTLs,and association analyses revealed that C1(CTAT)in Shenzhen population and D1(CTAA),D2(TTAA),D3(CCAT),D4(TTAT)and D5(CTAA)in cross-population might be the most advantageous diplotypes for growth traits.

Pinctadafucata;Quantitative trait locus(QTL);growth trait;verification

Q341

A

1001原6932（圓園17）05原園547原07

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.05.010

2015-09-12；

2016-11-07

廣東省漁業(yè)科技與發(fā)展專項(xiàng)（Z2014014；Z2015014）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B030301064）。

韋國(guó)建（1988-），碩士研究生，從事馬氏珠母貝分子育種。電子郵箱：weiguojian2014@163.com。

何毛賢，博士，研究員，從事貝類遺傳育種與分子生物學(xué)。電子郵箱：hmx@scsio.ac.cn。

（本文編輯：袁澤軼）