巴氏法聯合高滲鹽水對骨與軟組織惡性腫瘤體外滅活研究

高興，顧慶陟，陶開亮，樊雪鵬，李承鐸，李寶劍，李冬，田征*

(1.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫科大學第一附屬醫院骨科，新疆 烏魯木齊 830054；3.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154000)

實驗研究

巴氏法聯合高滲鹽水對骨與軟組織惡性腫瘤體外滅活研究

高興1，2，顧慶陟1，2，陶開亮1，2，樊雪鵬1，2，李承鐸1，2，李寶劍1，李冬3，田征1，2*

(1.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫科大學第一附屬醫院骨科，新疆 烏魯木齊 830054；3.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154000)

目的探討20%高滲鹽水對體外腫瘤細胞的滅活作用及溫度、時間效應關系，為臨床骨與軟組織惡性腫瘤進行自體骨滅活再植保肢手術提供指導。方法選取四肢及骨盆術前活檢確診為骨與軟組織惡性腫瘤患者24例，去除4例不符合條件病例，分三組分別在0.9%鹽水、20%高滲鹽水、巴氏法聯合高滲鹽水處理(15 min、30 min、45 min)，采用光鏡、透射電鏡觀察并計算腫瘤細胞滅活率。結果20%高滲鹽水及巴氏法聯合法各時間點腫瘤細胞滅活較0.9%等滲鹽水存在明顯差異，差異有統計學意義(P<0.01)；巴氏聯合法15 min優于20%高滲鹽水組(P<0.01)。結論20%高滲鹽水滅瘤作用確切，聯合巴氏法或增加滅瘤時間能明顯增加腫瘤細胞壞死率，增加滅瘤時間至30min以上滅瘤效果達到最佳。

高滲鹽水；惡性骨腫瘤；滅活；凋亡；骨肉瘤

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集2016年1月至2017年5月我科手術患者離體腫瘤標本24份，骨肉瘤12例，軟骨肉瘤5例，轉移癌6例，黏液炎性纖維母細胞肉瘤1例，女13例，男11例；年齡6～78歲。術前均經病理確診，12例骨肉瘤8例術前行新輔助化療治療，4例患者化療后切除腫瘤后測得腫瘤壞死率大于5%，予以剔除，其余病例納入實驗，1例軟骨肉瘤行術前化療，余術前未接受化療。

1.1.2 儀器與制劑 JEM-1230透射電鏡(日本電子株式會社)，萊卡顯微鏡、萊卡病理組織脫水機、萊卡石蠟包埋機、萊卡切片機、病理圖像采集系統(徠卡微系統有限公司)，水浴箱(上海躍進醫療器械廠)，伊紅染液、蘇木素染液(北京索萊寶科技有限公司)，EDTA(武漢市蓋云天生物技術有限公司)20%高滲鹽水(新疆醫科大學第一附屬醫院藥劑科)等。

1.2 方法

1.2.1 標記 每實驗病例準備10個標本盒，標注未處理空白參照一個；常溫0.9%等滲生理鹽水15 min、30 min、45 min時間段各一個標記；常溫20%高滲鹽水15 min、30 min、45 min時間段各一個標記；65℃ 20%高滲鹽水15 min、30 min、45 min時間段各一個標記。

1.2.2 采集處理組織 在腫瘤組織離體后將腫瘤沿最大縱徑拋開，結合影像學及肉眼觀察，選取無壞死組織層面，沿腫瘤同一層面將組織塊分成大小約1 cm×1 cm×1 cm 10份，沖洗組織塊，將1塊組織立即固定，其余9塊分3份分別放入常溫0.9%生理鹽水、常溫20%高滲鹽水、65℃ 20%高滲鹽水恒溫箱內分別計時至15 min、30 min、45 min，處理后分別放入4%中性甲醛溶液內固定，0.9%生理鹽水各時間點為空白對照組，甲醛立即固定組織作為生理鹽水組的參考標本。

1.2.3 制作病理切片 將不同處理因素下腫瘤組織充分固定后，骨組織經EDTA脫鈣液脫鈣[7]分別將組織脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色等制成病理切片。

1.2.4 判斷標準 依據細胞壞死的形態學特征[8]，細胞膜破裂，核濃縮、核碎裂、核溶解、胞漿嗜酸性染色加深的細胞表明已壞死，不納入計數；形態正常、細胞核和細胞膜完整的細胞納入計數。每張玻片隨機觀察10個高倍視野(放大400倍)，取其平均值。

1.2.5 滅活率計算方法[9]單個標本各時間點滅活率=(每高倍視野下生理鹽水對照中的腫瘤細胞數一每高倍視野下不同溫度下高滲鹽水各時間點的腫瘤細胞數)/每高倍視野下生理鹽水對照中的腫瘤細胞數×100%。

1.3 統計學方法 將20例腫瘤標本鏡下觀察數據輸入SPSS 24.0統計軟件包處理，用中位數、百分位數進行統計描述。實驗設計類型為成組設計，各時間點滅活率組間比較采用Kruskal Wallis秩和經驗，兩兩比較用Bonferroni校正法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 滅活骨及軟組織腫瘤HE染色光鏡下觀察 納入標本滿視野細胞壞死率小于等于2%，生理鹽水各時間點對照組壞死率無明顯增多，常溫20%高滲鹽15 min，細胞體積縮小，外圍常見一圍繞細胞環狀空白區，細胞核及染色質濃聚，以核濃縮及裸核為主。30 min，腫瘤壞死為胞核濃縮，胞漿嗜酸性變內部胞核濃縮進一步增強，核碎裂及核溶解細胞占比增多。45 min，細胞壞死仍以核濃縮為主，胞漿嗜酸性進一步增強，常可見小于3%片狀無法辨別的伊紅樣嗜酸性染色結構。巴氏法聯合15 min，腫瘤細胞仍以核濃縮壞死為主，核染色質嗜堿性增強，可見5%腫瘤壞死呈片狀嗜酸性紅染樣溶解。30 min，細胞壞死以核濃縮及核碎裂為主，核碎裂及核溶解較15 min時進一步增多。胞漿呈強嗜酸性改變并出現空泡樣改變，片狀無結構壞死進一步增多，45 min，細胞壞死以核濃縮及核碎裂為主，核碎裂及核溶解較30 min時增多，部分細胞于核濃縮細胞內可見白色空泡樣變化(見圖1)。

2.2 電鏡下表現 滅活骨及軟組織腫瘤電鏡下表現：常溫下生理鹽水組30 min細胞膜結構完整，細胞核染色質均勻分布，未見明顯溶解破壞，腫瘤細胞未見明顯壞死。常溫下20%高滲鹽水30 min細胞基質水腫明顯，可見空泡樣變，線粒體明顯腫脹、峭溶解明顯，腫瘤細胞壞死徹底。65℃ 20%高滲鹽30 min細胞核染色質明顯溶解，細胞核異染色質增生，分布在核膜周圍和核中央區域，腫瘤細胞壞死徹底(見圖2)。

2.3 各組腫瘤壞死率 20份腫瘤標本0.9%生理鹽水15 min、30 min、45 min滅活率小于2%，常溫下20%高滲鹽15 min滅活率82.77%，30 min、45 min滅活率100%，巴氏法聯合組，15 min滅活率92.03%，30 min、45 min滅活率100%(見表1)。

3 討 論

高滲鹽滅活機制是使腫瘤細胞極度脫水，造成腫瘤細胞內環境紊亂、代謝障礙，使腫瘤細胞不可逆性損害而死亡。對于滅活骨而言，20%的高滲鹽水不會使滅活骨深部骨基質中的蛋白質發生化學變性，鹽離子在溶液中是高度移動的。根據霍夫邁斯特效應，高濃度的鹽可能會保護靜電相互作用的蛋白質，從而進一步改變蛋白質的空間構象和它們的熱穩定性[10-11]。高滲鹽水被廣泛地用作蛋白質穩定劑和沉淀劑在生物化學與分子生物學；所以我們選擇使用高滲鹽水代替生理鹽水作為失活劑在滅瘤同時更好地保護蛋白質活性。20%的高滲鹽水是臨床使用最佳濃度。高濃度的氯化鈉是一種蛋白質穩定劑而不是蛋白變性劑[10]，這樣滅活骨內參與骨骼重建的細胞因子及骨誘導蛋白得以保留，斷端骨愈合不僅依靠骨傳導作用，而且還需要骨誘導作用。滅活骨作為“支架”，可激活間充質細胞和成骨細胞對骨形態發生蛋白基因的表達，合成并分泌內源性骨形態發生蛋白，且呈現出一定階段性，誘導滅活骨周圍肌肉及間充質細胞形成外生骨痂，促進修復愈合，隨著骨傳導不斷進行，宿主骨與滅活骨連接界面愈合，逐漸向骨段中間發展，最終完成骨性連接。

a 0.9%生理鹽水15 min b 0.9%生理鹽水30 min c 0.9%生理鹽水45 min

d 常溫20%高滲鹽15 min e 常溫20%高滲鹽30 min f 常溫20%高滲鹽45 min

g 巴氏聯合法15 min h 巴氏聯合法30 min i 巴氏聯合法45 min

a 常溫等滲鹽水30 min b 常溫20%高滲鹽30 min c 65℃ 20%高滲鹽30 min

圖2 各組處理后電鏡下形態改變(電鏡，×15 000)

高滲鹽水滅活再植的斷端愈合及力學強度研究，彭長亮等[4]在動物模型上，用20%高滲鹽水浸泡離體兔尺骨20 min進行回植后，行X線、三點彎曲負荷實驗，再植后3周即可見其近段有骨痂形成，骨外膜側有直接骨形成；6周時HE染色顯示骨基質內可見成堆的幼稚軟骨細胞增生，骨化而逐漸成骨，即為軟骨化骨。24周已接近正常骨；三點彎曲負荷實驗力學測試結果發現，6、12周生理鹽水對照側三點彎曲載荷明顯高于滅活骨，24周兩者差異無統計學意義。

滅活再植是一種理想的解決腫瘤切除后大段骨缺損的方法，瘤骨滅活再植的生物重建具有價格低廉、斷端骨愈合能力良好、恢復解剖重建等優點，但滅活技術必須在徹底殺滅骨內腫瘤細胞的同時，盡可能保留殘存骨力學強度、再生活性。術后復發及滅活骨出現骨折是亟需解決的問題。國內外學者報道液氮冷凍[8]、高溫蒸氣[12]、無水乙醇[13]、輻照滅活、巴氏法[3，6]等，均保證了足夠的腫瘤壞死率，但上述滅活方法中液氮、高溫等方法在滅瘤的同時嚴重破壞了骨的力學強度，術后骨折發生率高達20%～50%。我國常用的乙醇在骨的滅活中往往不易徹底殺滅腫瘤細胞，回植后局部復發率高，應用于骨肉瘤患者局部復發率可達20%以上，因而近年來已較少使用。實驗證明，骨組織用95%的乙醇浸泡20 min，只有薄層外側和髓腔皮層被侵及而被滅活，深部的腫瘤細胞只是被一層死骨殼緊緊包裹，與外界隔絕。乙醇滅活的缺點是滲透性差，滅活不徹底，局部復發率高達20%以上。與乙醇相比，高滲鹽水對骨的滲透性極強，能夠滲透到腫瘤的深部，從而保證殺死全部腫瘤細胞，且可以保留滅活骨骨基質中的骨形態發生蛋白及其他成骨誘導細胞因子，這些成骨誘導因子就能發揮作用誘導成骨，這為以后骨骼重建創造了比較有利的條件。高滲鹽水也廣泛應用于肝癌、包蟲病、淋巴瘤等治療，王俊江等[14]報道應用10%～20%高滲鹽聯合0.125%冰醋酸對肺包蟲囊內原頭蚴作用5 min即有損害作用，10 min損害更加嚴重，伊紅染色100%壞死，Sun等[15]從病理HE染色證實射頻聯合高滲鹽水對兔子肝臟腫瘤滅活效果確切，Bikowski等[16]應用23.4%的高滲鹽水于局限性淋巴瘤患者，注射后患者癥狀明顯緩解，以局部色素沉著為最小副作用為代價，Gennar等[17-18]報道應用20%高滲鹽水于脊柱骨包蟲的輔助治療取得了滿意的效果，高滲鹽水廣泛應用于各種疾病的治療且獲得滿意效果，文獻中對高滲鹽水的濃度、時間、溫度報道不盡相同，郭衛等[2-4]報道應用10%～20%高滲鹽水浸泡20 min、30 min、45 min滅瘤均取得滿意的結果，文獻報道對滅活時間多在30 min，在較為廣泛臨床應用的同時文獻中鮮有對腫瘤滅活時間相關的基礎形態學研究報道，在我們的研究中常溫20%高滲鹽水15 min時不能完全對腫瘤細胞完全滅活，達到30 min后才可徹底滅活瘤骨，有學者也報道當高滲鹽水成為腫瘤單一滅活因素時腫瘤壞死不徹底容易復發[5]，國內外文獻報道高滲鹽聯合20%巴氏法滅活效果更徹底[2，6]，且巴氏法具有對骨力學性能達到最少滅活影響。

巴氏法對骨相關惡性腫瘤的滅活是一種行之有效的方法。在此基礎上，一些研究已經完成對這些骨愈合相關蛋白在滅活骨的活動。人骨形態發生蛋白在骨的成骨活性可以得到一定的保留在巴氏法中[19]，這可能會促進骨折愈合時的成骨。臨床和實驗研究表明，加熱是一種有效的殺滅腫瘤細胞的方法。Qu等[6]學者研究65℃ 20%高滲鹽應用于27例骨惡性腫瘤30 min后平均隨訪時間62.8個月數據對比單純巴氏法、放射、高溫、同種異體骨在骨斷端不愈合率、平均骨愈合時間、深部感染率、骨折發生率均優于其他滅瘤方法，此滅瘤方法正是巴氏法聯合高滲鹽的滅瘤方法。

為獲得高滲鹽水最佳滅瘤時間和效果，做了上述實驗研究，認為20%高滲鹽水15 min時不能完全對腫瘤細胞完全滅活，聯合巴氏法對腫瘤細胞滅活明顯增強，但仍然不能達到最佳滅瘤效果，30 min及以上時滅活均可以達到滿意滅瘤效果，但聯合巴氏法滅瘤效果更加確切，對腫瘤細胞的殺傷更加徹底，聯合巴氏法15 min，腫瘤細胞仍以核濃縮壞死為主，核染色質嗜堿性增強，可見5%腫瘤壞死呈片狀嗜酸性紅染樣溶解。30 min、45 min，細胞壞死以核濃縮及核碎裂為主，核碎裂及核溶解較15 min時明顯增多。胞漿內可見大量氣泡樣變性，且無結構樣片狀壞死明顯增多，進一步在電鏡下對細胞壞死進行驗證，細胞核染色質明顯溶解，細胞質明顯腫脹，線粒體腫脹呈氣球樣變，得出腫瘤細胞壞死徹底。

本研究也存在一些不足之處：a)標本納入量較少，由于骨與軟組織腫瘤發病率較低，百萬基數中可能病發幾例患者，發病率低給實驗造成了困難。b)納入疾病種類不一，在對骨與軟組織腫瘤高滲鹽水研究過程中，發病率低致使很難收集單一腫瘤進行研究，各種腫瘤細胞可能對高滲鹽水的生存抵抗存在著差異，對這種差異在混合病種研究中不能發現。c)研究時間跨度較大，考慮到巴氏法滅菌是60～65℃加熱30 min才能達到聯合作用，實驗設計了時間15 min、30 min、45 min 3個時間段，實驗得出30 min即可達到理想效果，在縮短滅活時間至20 min時可能也會達到相同效果，今后我們會針對上述不足繼續改進收集較多病理標本，精準實驗時間繼續探索研究。

滅活瘤骨移植具有廉價、解剖重建、力學性能穩定等優點可以作為一個良好的選擇，20%高滲鹽30 min及以上對離體骨與軟組織惡性腫瘤可以完全滅活，聯合巴氏法可使瘤細胞滅活更徹底，20%高滲鹽是一種良好及有效的滅活再植方法。良好的滅瘤結果和可接受的并發癥發生率使它成為一個合適的替代金屬假體修復節段性骨缺損的方法。未來隨著高滲鹽水的研究更加深入，高滲鹽水可能廣范應用于骨與軟組織惡性腫瘤滅活再植治療中，同時也可用于骨巨細胞瘤等良性腫瘤的輔助治療，高滲鹽水安全、易得、價廉，在各層次醫院均較易獲得，為我國廣大基層醫院治療骨與軟組織良惡性腫瘤提供更多的治療選擇。

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InVitroInactivationoftheMalignantTumorsofBoneandSoftTissuebyPasteurizationCombinedwithHypertonicSaline

Gao Xing1，2，Gu Qingzhi1，2，Tao Kailiang1，2，et al

(1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

ObjectiveTo study the effect of 20% hypertonic saline on the in vitro inactivation of tumor cells and its relationships with temperature and time，and to provide guidance for the inactivation of autologous bone and limb salvage operation in the treatment of clinical malignant tumors of bone and soft tissue.Methods24 patients who were diagnosed with malignant tumors of bone and soft tissue according to the biopsy of limbs and pelvis before operation were chosen，and 4 patients who didn’t meet the requirement were removed.The samples were treated with 0.9% saline，20% hypertonic saline，and pasteurization treatment combined with hypertonic saline (15，30，45 min) and were observed by optical microscope，transmission electron microscope.The inactivation rate of the tumor cells were calculated.ResultsInactivated tumor cells at 20% hypertonic saline and pasteurization combined with hypertonic saline at each time were obviously different compared with 0.9% isotonic saline，and the difference was statistically significant (P<0.01).The effect of inactivating of 15 min pasteurization combined with hypertonic saline was better than 20% hypertonic saline group (P<0.01).ConclusionThe effect of 20% hypertonic saline on tumor elimination is reliable，and combining with pasteurization or increasing the time of killing tumor cells can obviously increase the necrosis rate of tumor cells.The time of killing tumor cells is more than 30 min，and the effect of killing tumor will be best.

hypertonic saline；malignant bone tumor；inactivation；apoptosis；osteosarcoma

1008-5572(2017)10-0899-05

R738.6

A

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2014211C034)；*本文通訊作者：田征

高興，顧慶陟，陶開亮，等.巴氏法聯合高滲鹽水對骨與軟組織惡性腫瘤體外滅活研究[J].實用骨科雜志，2017，23(10)：899-903.

2017-07-17

高興(1990- )，男，研究生在讀，新疆醫科大學，新疆醫科大學第一附屬醫院骨科，830054。

骨與軟組織肉瘤屬于罕見疾病[1]，僅占成人所有癌種的0.2%，以兒童及青少年發病居多，新輔助化療及Enneking外科分期概念的推廣，保肢手術已成為治療惡性骨與軟組織腫瘤的經典術式。保肢手術有人工假體置換、同種異體骨移植、自體骨滅活再植等方法，人工假體價格昂貴，同種異體骨因我國缺乏大型骨庫且供體較少，常不能實現，自體骨滅活再植相對廉價、且無免疫排斥等問題，是一種重要的重建術式，滅瘤方法主要有：高壓蒸氣、液氮、輻照或無水乙醇、高滲鹽水化學滅活后植回原位，然后輔助內固定裝置達到解剖上的重建，高滲鹽水有著操作方便、使用安全、滅活后對移植骨的力學強度影響較小等特點。

目前國內外對高滲鹽水的臨床應用研究較為廣泛，多數研究集中在包蟲病的輔助滅活，肝、腎、淋巴等實體腫瘤的注射滅瘤，均取得了較為滿意效果。高滲鹽水在骨與軟組織惡性腫瘤治療中應用較少，國內學者對高滲鹽的研究自2000年起主要以北京大學人民醫院骨與軟組織腫瘤治療中心郭衛等[2-4]報道10%～20%高滲鹽浸泡離體負瘤骨行滅活再植，高滲鹽水應用時間在10～30 min之間滅瘤均取得滿意的效果，國外學者對高滲鹽水在骨與軟組織惡性腫瘤鮮有報道，目前研究者對高滲鹽水在骨與軟組織滅瘤再植的滅活時間尚沒有定論，臨床應用多集中在30 min，尚缺乏高滲鹽水滅瘤后時間因素腫瘤壞死率的基礎研究，為獲得高滲鹽水最佳滅活時間及對細胞壞死形態學的基礎研究，本研究針對不同時間20%高滲鹽水進行分組實驗，希望為臨床骨與軟組織腫瘤離體滅活再植縮短手術時間，避免因長時間手術增加相關并發癥發生率，提供有力理論依據，同時有學者報道當高滲鹽水成為腫瘤單一的滅活因素時腫瘤壞死不徹底容易復發[5]，有學者提出增加溫度至65℃成為聯合巴氏法滅瘤方法，效果將進一步增強[3，6]，但兩種方法均缺少基礎研究的報道，為探究20%高滲鹽水是否滅瘤效果確切且聯合巴氏法進一步增強滅瘤效果，特進行如下實驗。