響應面法優化可溶性花生粕蛋白提取工藝

馬武生，孫長花，張占軍，王君，蔡長春，張夏華

（1.揚州市職業大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009；2.江南大學環境與土木工程學院，江蘇無錫214122）

響應面法優化可溶性花生粕蛋白提取工藝

馬武生1，2，孫長花1，張占軍1，王君1，蔡長春1，張夏華1

（1.揚州市職業大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009；2.江南大學環境與土木工程學院，江蘇無錫214122）

在單因素試驗基礎上，采用響應面法確定乙醇溶液-酶法提取花生粕蛋白的最佳條件。中心組合設計的獨立變量包括乙醇體積分數、液料比、提取時間和pH值，以蛋白提取率為響應值，建立了二階多項式非線性回歸方程和數值模型。結果顯示，蛋白提取率二階模型相關系數為96.9%。響應量主要受pH值、提取時間和液料比的影響。乙醇體積分數為60%、pH值為6.4、提取時間為70 min和液料比為23∶1（mL/g）時可獲得最大提取率（63.16%），該最佳提取條件獲得了試驗結果的充分證實。研究表明，中心組合設計-響應面法可應用于花生粕蛋白提取工藝的優化分析。

響應面法；花生粕；工藝優化；蛋白質提取；中心組合設計

我國花生年產量穩定在1 500萬噸左右，位居世界第一[1]。除部分花生直接食用外，有50%～60%用來榨油[2]，每年產生超過200萬噸的副產品——花生粕[3-4]。花生粕營養價值較高，蛋白質含量高達40%～50%，其中10%為清蛋白，90%為球蛋白[5]，含有人體所需的8種氨基酸，蛋白質凈利用率為51，生物價為59，純消化率可達90%以上，極易為人體消化所吸收[6]。因此，花生粕是一種較好的植物蛋白來源，可進一步加工成高蛋白質含量的產品，具有很好的經濟價值和社會意義。然而大部分花生油生產工藝為機械壓榨法和有機溶劑浸出法[7]。經過高溫高壓處理后的花生粕，蛋白質變性嚴重，有效氨基酸破壞明顯，無法直接應用于食品工業，致使花生粕應用受到限制，需要進行有效提取。目前花生蛋白提取方法有堿法提取[8]、超聲提取[9]、高壓勻漿提取[7]、酶法提取[10]和乙醇浸提[11]等。堿法基于堿溶酸沉法進行提取，可制備氮溶解指數較高的產品，但蛋白提取率低；超聲處理存在成本高和設備效率低問題；高速勻漿法能耗較大；酶法則是利用酶促反應促進花生粕蛋白的溶出，通過控制限制性酶促反應保障產物特異性，且可促進碳水化合物的降解，有利于花生蛋白純度的提高，具有能耗低的優點；乙醇浸提法可獲得風味和色澤俱佳的濃縮蛋白，但蛋白濃度偏低[12]。故此制備溶解性能優、蛋白質含量高的花生蛋白是目前急需解決的問題。

本研究采用乙醇溶液作為浸提溶劑，利用酶法提取花生粕蛋白，在單因素試驗的基礎上，選取合理試驗因素和數值區間，利用中心組合設計-響應面法（CCD-RSM）對花生粕蛋白最佳提取工藝條件進行了研究，除獨立變量影響的分析外，還獲取二階數學模型來描述蛋白提取的生化過程，為花生粕蛋白質的工業化生產與應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

花生粕（花生經過機械壓榨提油后副產品）：市售；中性蛋白酶（＞20萬U/mg）：東恒華道生物科技有限責任公司；苯酚、考馬斯亮藍G-250、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

1.2 試驗設備

202-1ES型電熱數顯恒溫干燥箱：上海新諾儀器設備有限公司；TGL-10B型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；FA3204B型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；PHSJ-4F型精密酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SHA-C型恒溫水浴鍋：金壇市精達儀器制造有限公司；CJJ78-1型磁力攪拌器：江蘇省金壇市大地制動化儀器廠；TU-1901型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 樣品的制備

花生粕在50℃烘箱干燥2 h，然后粉碎后過60目篩，用聚乙烯塑料袋包裝，室溫下存放備用。干燥前后分別對花生粕樣品進行工業分析。

1.4 方法

1.4.1 原料成分分析

脂肪含量：采用索氏抽提法測定[13-14]。蛋白質含量：采用微量凱氏定氮法測定[14-15]。總糖含量：采用苯酚-硫酸法測定[16]。水分含量：采用恒重法測定[14，17]。灰分含量：采用灼燒法測定[14，18]。

1.4.2 花生粕蛋白的提取工藝

在恒溫下，稱取10 g粉碎后花生粕粉于玻璃容器中，加入一定量和體積分數的乙醇溶液，使用0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl調節懸浮液pH值一定值，根據花生粕質量添加一定比例中性淀粉酶，酶解一定時間。酶解結束后，將反應容器放置沸水浴中5 min，使酶失活。漿液在4 000 r/min下離心20 min，收集上清液，采用Bradford法測定蛋白含量。所有試驗均進行一式3份。

蛋白質提取率計算公式為：

蛋白提取率/%=蛋白溶出量/花生粕蛋白量×100

1.4.3 花生粕蛋白提取單因素影響分析

以離心后上清液中的可溶性蛋白含量為評價指標，以液料比為 15 ∶1（mL/g）、加酶量為 0.4%（酶量/花生粕干重）、提取時間為60 min、反應溫度為40℃、pH值為6.0，乙醇體積分數為70%為基準條件，分別研究乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、液料比[10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）]、加酶量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、提取時間（20、40、60、80、100 min）、反應溫度（30、35、40、45、50 ℃）及pH 值（pH=4、5、6、7、8）等因素變化對可溶性花生粕蛋白提取率的影響。

1.4.4 CCD-RSM優化研究

CCD-RSM是一種尋找多因素系統中最佳條件的數理統計方法，用于受多個變量影響的復雜灰色體系的優化分析、多變量非線性體系的優化和考察交互作用影響，以較少試驗次數和較短時間對所選擇的試驗參數進行全面研究，且通過全局函數關系構建，實現多項式方程擬合和建模[19-20]。該項研究中，根據單因素的試驗結果，利用Design-Expert 10軟件進行中心組合試驗設計，優化花生粕蛋白提取工藝條件。利用Minitab 17軟件進行回歸方程擬合和模型的構建。

2 結果與分析

2.1 花生粕的工業分析

測定花生粕原料中的水分、粗蛋白、可溶性總糖、粗脂肪和灰分等含量（見表1）。

表1 花生粕工業分析Table 1 Proximate analysis of peanut meal

從表1可以看出，花生粕主要成分是蛋白質和糖類，水分和灰分含量可觀，一定程度上降低了花生粕品質。干燥后蛋白質和糖類分別占到重質量的46.2%和28.0%，與其他食品原料相比，花生粕中含有豐富的蛋白質，可作為一個潛在的非常規蛋白質來源。

2.2 花生粕蛋白提取的單因素分析

2.2.1 乙醇體積分數對提取率的影響

乙醇體積分數對提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分數對蛋白提取率的影響（n=3）Fig.1 Effect of ethanol content on protein extraction yield（n=3）

由圖1可知，乙醇體積分數增大將降低花生粕蛋白的提取率，因為增大乙醇體積分數對酶活性產生抑制作用，尤其乙醇體積分數大于70%時，蛋白酶活性大大降低，故此選取乙醇體積分數＜70%為宜。

2.2.2 液料比對提取率的影響

液料比對提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對蛋白提取率的影響（n=3）Fig.2 Effect of solvent/meal ratio on protein extraction yield（n=3）

從圖2看出，液料比增大有助于提高蛋白的溶出總量，但是當液料比＞25 ∶1（mL/g）時，提取率呈下降趨勢。這可能因為過多的提取液降低溶液中蛋白濃度，增大后期蛋白分離的困難和成本，同時也會降低蛋白酶的濃度，影響酶與底物相互結合的幾率，從而使蛋白的溶出量減少。

2.2.3 加酶量對提取率的影響

加酶量對提取率的影響見圖3。

圖3 加酶量對蛋白提取率的影響（n=3）Fig.3 Effect of enzyme concentration on protein extraction yield（n=3）

酶量增加可顯著提高蛋白提取率，這主要因為酶量增加促進了酶促反應的速率。當加酶量≥0.5%時，溶液中底物全部被酶飽和，蛋白提取率達到最大值并維持穩定。

2.2.4 提取時間對提取率的影響

提取時間對提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對蛋白提取率的影響（n=3）Fig.4 Effect of extraction time on protein extraction yield（n=3）

隨著提取時間延長，蛋白提取率增大，但超過60 min時，蛋白提取率增幅降低，這可能與底物投加量有關，此時大部分底物已水解或部分酶已失活，造成蛋白提取率增幅停滯。

2.2.5 反應溫度對提取率的影響

反應溫度對提取率的影響見圖5。

溫度在40℃～45℃時，蛋白提取率最高，溫度繼續上升，蛋白提取率迅速下降，這主要因為溫度超出酶促反應的最適溫度范圍，有機溶劑更加促進酶的鈍化與變性。

圖5 反應溫度對蛋白提取率的影響（n=3）Fig.5 Effect of temperature on protein extraction yield（n=3）

2.2.6 pH值對提取率的影響

pH值對提取率的影響見圖6。

圖6 pH值對蛋白提取率的影響（n=3）Fig.6 Effect of pH on protein extraction yield（n=3）

蛋白提取最佳pH值為6～8。當pH=4～6時，處于蛋白等電點數值范圍，不利于蛋白的溶出，從而造成蛋白提取率較低。當pH值＞7時，雖然已超過α-蛋白酶最適pH值，但由于蛋白具有更好的堿溶性特點，故此pH值＞7時，整體蛋白提取率基本維持穩定。

2.3 響應面法優化花生粕蛋白提取工藝

2.3.1 試驗設計

根據單因素試驗結果可知，存在最適加酶量與酶解溫度。在最適范圍內，兩參數對蛋白提取率影響不顯著，因此選取加酶量和水解溫度為定值（分別為0.5%和 40 ℃），乙醇體積分數（x1）、pH（x2）、提取時間（x3）和液料比（x4）為中心組合設計的4個獨立變量，每個變量在 5 個水平進行編碼：-2、1、0、1和 2（見表 2）。從編碼變量（Xi）水平到零變量水平（xi）由以下方程給出：

式中：Xi是一個獨立的無量綱變量；xi是獨立變量的實際值是在中心點獨立變量的實際值；Δxi是因素的變化間距；X1、X2、X3和 X4分別表示乙醇體積分數、pH值、提取時間和液料比。

表2 中心組合設計的變量和水平Table 2 Variables and levels for central composite design

可溶性蛋白提取率作為研究的響應函數（Y），進行4因素5水平的CCD中心組合試驗設計，共獲得29種獨立變量組合。立方體點各點坐標皆為+1或-1，在n個因素的情況下，共有2n個立方點（1號～16號）；星號點分布在軸向上，除一個坐標為+α或-α外，其余坐標皆為0，在n個因素的情況下，共有2n個星點（17號～24號）；中心點坐標皆為0，本研究中心點設置5個重復試驗（25號～29號），用于降低系統誤差和隨機誤差。所有試驗順序隨機進行，以盡量減少外部因素對觀察響應的影響。響應值（Y）的二階模型見式子（3）：

式中：b0是設計中心點擬合的響應值，即點（0，0，0，0）；bn、bnn和 bnm分別是線性、二次和交互項。

優化過程中的目標是為相關變量尋找一個共同值，故此采用滿意度函數法。將響應值（Y）轉化為d值，使用Minitab軟件使它落在區間[0，1]內，根據期望達到的最優值確定響應值的滿意度。在本研究中期望響應值盡可能地高，理想值為1，可接受的值為0.8～0.6。在這些條件下開展試驗來驗證最佳條件。

2.3.2 數據統計分析

蛋白質產率的中心組合設計及29組試驗結果和預測值見表3。試驗結果表明，花生粕可溶性蛋白提取率為41.60%～63.66%。應用RSM可得編碼變量的二次多項回歸方程，該方程是蛋白質產量（Y）和試驗變量編碼單元（Xi）之間的經驗關系式（4）：

由各試驗點實際值與響應值得到實際回歸方程

表3 蛋白質產率的中心組合設計、響應和預測值Table 3 Central composite design arrangement，responses and predicted values for protein yield

利用該回歸模型可計算出蛋白質產量的預測值，與試驗值對比后結果如圖7所示。皮爾森相關系數為0.985，相關系數（R2）為0.969，說明兩個變量線性相關性極強，采用該模型可合理擬合試驗數據。對回歸模型進行方差分析（ANOVA），結果見表4。

圖7 蛋白提取率試驗值和預測模型關系Fig.7 Comparison between predicted and observed protein yield

利用t檢驗和p值可判斷各相關系顯著性，由ANOVA結果可知，回歸模型變量間關系極顯著（p＜0.001），模型變量失擬不顯著（p＞0.05）。pH（X2）、提取時間（X3）、液料比和交互作用項 X2X3極顯著（p＜0.001），說明pH值、提取時間和液料比是最重要的影響因素。此外，提取時間（X2）和液料比（X4）的交互作用近似表現為顯著（p=0.06，接近0.05），而乙醇體積分數（X1）不是一個顯著影響因素（p＞0.05）。

該模型的變異系數（CV）為2.42%，一般情況下，CV不大于10%即可認為具有合理性，故此該模型具有較好的重現性。總體來講，該回歸模型擬合程度較好，可以用來預測和確定花生粕蛋白提取的最佳工藝條件。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

2.4 工藝優化

固定2個變量為編碼零水平，通過改變剩余2個變量測定響應值（蛋白質提取率），繪制三維曲面圖來闡明獨立變量及其交互影響。

4個獨立變量比對蛋白質提取的影響見圖8。

圖8 花生粕蛋白質產率曲面圖Fig.8 Surface plots for protein extraction yield of peanut meal

由圖8a～8b可知，隨著液料比和pH值的增加，蛋白提取率顯著增加；當繼續增大時，由于液料比的稀釋作用，或超出最適pH值范圍，提取率反而下降。故液料比和pH值對蛋白提取率具有二次項效應。在選定的乙醇體積分數范圍內，乙醇體積分數似乎對蛋白提取沒有影響（圖8a～8c），而提取時間對提取效果具有線性響應（圖8c）。圖8d描述了pH值和液料比的影響，結果表明pH值和液料比都對提取具有二次方效應，恰當增加pH值和液料比可獲得更高的蛋白提取率。圖8e給出了提取時間、液料比對蛋白質產率的影響，結果表明，提取時間對蛋白提取沒有顯著影響，而增加液料比有助于對蛋白提取率的提高。圖8f顯示，pH值和提取時間的交互作用呈馬鞍狀，對蛋白提取具有二次效應，其原因可能是，在適宜pH值情況下，酶保持較高活性及蛋白質分子呈現較佳的堿溶性，再結合圖8e可知，在調查范圍內蛋白提取率更多由pH值影響，而不是提取時間。綜上，液料比和pH值對蛋白質產率影響顯著，提取時間次之，而乙醇體積分數影響有限。

2.5 方程最優解與試驗驗證

使用Minitab軟件滿意度函數法確定最佳提取工藝條件。結果顯示，乙醇體積分數為60%、pH值為6.4、提取時間為 70 min 和液料比為 23 ∶1（mL/g）是花生粕蛋白提取的最佳條件。將獨立變量最佳條件值帶入回歸方程，預測模型方程響應值的適用性，得到蛋白提取率預測值為63.16%。而該條件下，試驗獲得的結果為63.67%，說明擬合方程預測值和試驗觀測值具有良好的一致性。

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用CCD-RSM法應用于乙醇-酶法提取花生粕蛋白的工藝優化研究，并建立了二階多項式非線性回歸方程和數值模型。花生粕蛋白提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分數=60%、pH=6.4、提取時間=70 min 和液料比=23 ∶1（mL/g），該條件下花生粕可溶性蛋白質提取率為63.16%。回歸模型不失擬，預測值和試驗觀測值具有良好的一致性。通過三維曲面圖分析可知，在取值區間內，液料比、提取時間和pH值的蛋白質產率具有顯著影響，而乙醇體積分數影響有限。該研究表明，中心組合設計-響應面法可有效的優化花生粕蛋白提取工藝。

[1]Su G,Ren J,Bao Y,et al.Comparison of hydrolysis characteristics on defatted peanut meal proteins between a protease extract from Aspergillus oryzae and commercial proteases[J].Food Chemistry,2011,126(3):1306-1311

[2]Wu H,Qiang W,Ma T,et al.Comparative studies on the functional properties of various protein concentrate preparations of peanut protein[J].Food Research International,2009,42(3):343-348

[3]梅娜,周文明,胡曉玉,等.花生粕營養成分分析[J].西北農業學報,2007,16(3):96-99

[4]Panesar P S,Kennedy J F,Knill C J,et al.Applicability of pectateentrapped Lactobacillus casei cells for l(+)lactic acid production from whey[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2007,74(1):35-42

[5]Gemeiner P,Kurillová L,Malovíková A,et al.Properties of spherical calcium pectate and alginate gels and their use in diffusion chromatography,solids separations and immobilization of enzymes and cells[J].Folia Microbiologica,1989,34(3):214-227

[6]Nahálka J,Liu Z,Gemeiner P,et al.Nucleoside triphosphates production using recombinant Escherichia coli entrapped in calcium pectate gel[J].Biotechnology Letters,2002,24(11):925-930

[7]高云中.花生粕蛋白的提取及性質研究[D].無錫:江南大學,2009

[8]Borzelleca J F,Jr L J F,Kinoshita F K,et al.Evaluation of the safety of sodium pectate as a food ingredient[J].Food&Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,1996,34(1):21-25

[9]高麗霄,劉冬,徐懷德,等.高溫花生粕中花生蛋白提取工藝研究[J].食品工業科技,2012,33(5):273-276

[10]Wehr J B,Menzies N W,Blamey F P C.Alkali hydroxide-induced gelation of pectin[J].Food Hydrocolloids,2004,18(3):375-378

[11]趙雪淞,張鑫磊,劉民.醇法生產花生濃縮蛋白的工藝條件研究[J].中國油脂,2014,39(8):30-33

[12]Yu J,Ahmedna M,Goktepe I.Peanut protein concentrate:Production and functional properties as affected by processing[J].Food Chemistry,2007,103(1):121-129

[13]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的測定[S].北京:中國標準出版社,2004

[14]AOAC.Official methods of analysis of the association of official analytical chemists[M].Virginia,USA:AOAC Inc,1997

[15]中華人民共和國衛生部.GB 50095-2010食品安全國家標準食品中蛋白質的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[16]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 15672-2009食用菌中總糖含量的測定[S].北京:中國標準出版社,2009

[17]中華人民共和國衛生部.GB 5009.3-2010食品安全國家標準食品中水分的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[18]中華人民共和國衛生部.GB 5009.4-2010食品安全國家標準食品中灰分的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[19]王永菲,王成國.響應面法的理論與應用[J].中央民族大學學報:自然科學版,2005,14(3):236-240

[20]王敏,陸兆新,呂鳳霞,等.響應曲面法優化酶法提取銀杏葉總黃酮[J].食品科學,2007,28(3):117-121

Optimization of Extraction Conditions of Soluble Proteins from Peanut Meal by Response Surface Methodology

MA Wu-sheng1，2，SUN Chang-hua1，ZHANG Zhan-jun1，WANG Jun1，CAI Chang-chun1，ZHANG Xia-hua1
（1.School of Biochemical Engineering，Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.School of Environmental and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Response surface methodology was used to determine optimum conditions for extraction of protein from peanut meal based on the results of single factor experiments.A central composite design including independent variables such as ethanol content，solvent/meal ratio，extraction time，and pH.Protein extraction yield was used as the response value.Selected response which evaluates the extraction effect was protein yield and the second-order model obtained for protein yield revealed coefficient of correlation of 96.9%.Protein extraction yield was primarily affected by pH，extraction time and solvent/meal ratio.The maximum yield was obtained when the ethanol content，pH，extraction time and solvent/meal ratio were 60%，6.4，70 min，23 ∶1（mL/g），respectively.Under these conditions，the extraction rate of soluble protein of peanut meal was 63.16%.The adequacy of the model was confirmed by the experimental results under optimum values given by the model.The research indicated that CCD-RSM could be proven to be process optimization of soluble proteins from peanut meal.

response surface methodology；peanut meal；process optimization；protein extraction；central composite design

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.009

江蘇省自然科學基金項目（BK 2014 1269）

馬武生（1977—），男（漢），博士研究生，研究方向：污染治理與廢物資源化。

2017-01-14