UPLC-MS/MS法測(cè)定涼茶飲料中的有機(jī)酸和黃酮類化合物

韓婉清，王斌，王莉，冼燕萍

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州），廣州市食品安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市食品安全風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與預(yù)警研究中心，廣東廣州510000）

UPLC-MS/MS法測(cè)定涼茶飲料中的有機(jī)酸和黃酮類化合物

韓婉清，王斌，王莉，冼燕萍*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州），廣州市食品安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市食品安全風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與預(yù)警研究中心，廣東廣州510000）

建立一種超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定涼茶飲料中5種有機(jī)酸和黃酮類化合物的方法。樣品經(jīng)高速離心，甲醇稀釋后，經(jīng) BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離，乙腈-0.1%甲酸水（體積分?jǐn)?shù)）梯度洗脫，串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)。5種目標(biāo)物的方法檢出限在0.2 mg/L～0.5 mg/L，在0.02 mg/L～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。添加水平為1.0 mg/L～40 mg/L時(shí)，平均回收率為86.3%～102%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為2.4%～8.7%。

涼茶；有機(jī)酸；黃酮類化合物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

涼茶是由藥食同源的植物為原料，經(jīng)熬制后具有清熱解毒、生津止渴等功效的植物飲料。由于涼茶是采用化學(xué)成分尚不明確的植物原料熬制而成的復(fù)方制劑，產(chǎn)品成分復(fù)雜，目前尚未有關(guān)于涼茶具體組分的明確報(bào)道，僅有國(guó)內(nèi)部分機(jī)構(gòu)利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行主要活性成分的定性篩查。游飛祥等利用高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography of quadrupole time of flight-mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）分析鑒定了植物涼茶中的化學(xué)成分，共鑒定出43種有機(jī)酸類和黃酮苷類物質(zhì)[1]。梁慧等利用HPLC-TOF-MS和高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜（high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometric，HPLC-IT-MS）進(jìn)行癍痧涼茶的化學(xué)成分分析，鑒定出主要活性成分為有機(jī)酸、黃酮類和三萜皂苷類物質(zhì)[2]。但是，對(duì)涼茶飲料中這些活性成分的定量測(cè)定鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于有機(jī)酸、黃酮類化合物的檢測(cè)方法研究，主要集中在果汁[3]、酒[4]、植物性食品[5]、中草藥[6]等領(lǐng)域，所用方法多為液相色譜法[7-8]、離子交換色譜法[9]，亦有關(guān)于毛細(xì)管電泳[10]、氣相色譜[11]等方法的報(bào)道。這些檢測(cè)方法都存在因易受基質(zhì)干擾而造成假陽(yáng)性的缺陷，因此對(duì)樣品的凈化要求高。本文采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定涼茶飲料中奎寧酸、綠原酸、甘草苷、柚皮苷、槲皮素等5種有機(jī)酸和黃酮類物質(zhì)，5種目標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 5種目標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of 5 target compounds

由于涼茶飲料成分復(fù)雜，植物源性激素、多糖、色素等物質(zhì)的存在都可能對(duì)目標(biāo)物的痕量檢測(cè)造成干擾，本試驗(yàn)采用串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，具有良好的選擇性和抗干擾能力，方法可在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量，滿足市售實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC-MS/MS ACQUITYTM-XevoTMTQ MS超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司；5418高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；MS3 basic渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國(guó)Millipore公司。

綠原酸（Chlorogenic acid，CAS327-97-9，純度95%）、奎寧酸（D-Quinic acid，CAS：77-95-2，純度98%）、甘草苷（Liquirtin，CAS：551-15-5，純度99%）、槲皮素（Quereetin，CAS：117-39-5，純度 98%）、柚皮苷（Naringin，CAS：10263-47-2，純度 98%）：德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇：HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司；甲酸：HPLC級(jí)，德國(guó)CNW公司；超純水（18.2 MΩ）。

5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用少量水溶解后，加入甲醇定容，配制成單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別吸取適量的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃避光保存，臨用前用甲醇稀釋成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

5份市售分析樣品：3份自制涼茶購(gòu)自廣州市散裝涼茶零售店；1份干粉狀涼茶購(gòu)自網(wǎng)絡(luò)；1份預(yù)包裝植物涼茶飲料購(gòu)自廣州市內(nèi)超市。

1.2 供試溶液的制備

取適量涼茶樣品，13 000 r/min高速離心5 min，吸取1.0 mL上清液，加入甲醇稀釋并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

涼茶干粉按說(shuō)明書所述比例，用超純水沖制成涼茶溶液后，按上述方法進(jìn)行供試液的制備。

1.3 儀器條件

色譜柱：BEHC18色譜柱，100mm×2.1mm，1.7μm；流動(dòng)相：A.0.1%甲酸水溶液（體積分?jǐn)?shù)），B.乙腈，梯度洗脫程序：0.0 min～4.0 min，80% ～5%A；4.0 min～5.0 min，5%A；5.0 min ～5.1 min，5%～80%A。流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30℃。5種待測(cè)物的保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 5種待測(cè)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜分析條件Table 1 Retention time and MS parameters for the analysis of 5 target compounds

質(zhì)譜條件：ESI負(fù)模式；毛細(xì)管電壓1.5 kV；離子源溫度150℃；去溶劑氣溫度400℃；去溶劑氣：氮?dú)猓?00 L/h；錐孔氣：氮?dú)猓?0 L/h；碰撞氣：高純氬氣，0.15 mL/min；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；5種目標(biāo)物監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）及錐孔電壓、碰撞能等參數(shù)見(jiàn)表1，每個(gè)離子對(duì)的駐留時(shí)間均為0.06 s。

2 結(jié)果和討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

5種目標(biāo)物中，有機(jī)酸分子結(jié)構(gòu)中含有羧基，黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，在ESI-電離方式下均可獲得豐度較高的脫氫準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，對(duì)各目標(biāo)物分別優(yōu)化錐孔電壓使各母離子豐度達(dá)到最大。對(duì)確定的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，各目標(biāo)物的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)表2。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令的要求，每種化合物（除綠原酸外）均選擇2個(gè)特征碎片離子作進(jìn)行定量和定性，通過(guò)優(yōu)化碰撞能，使特征碎片離子豐度達(dá)到最大，經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表2 5種目標(biāo)物的質(zhì)譜裂解途徑Table 2 Fragmentation pathways of 5 target compounds

試驗(yàn)比較了 BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和 BEH T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱對(duì) 5種待測(cè)物的分離效果（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示，目標(biāo)物經(jīng)T3柱分離后，綠原酸會(huì)出現(xiàn)分峰現(xiàn)象（分裂成Rt=2.47 min和 3.44 min），甘草苷（Rt=4.35）和柚皮苷（Rt=4.47）不能完全分離；經(jīng)C18柱分離后，各目標(biāo)物能實(shí)現(xiàn)完全分離，峰型尖銳，響應(yīng)較高。因此，選擇BEH C18色譜柱分離。

比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水（體積分?jǐn)?shù)）和乙腈-10 mmol/L乙酸銨3組流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)和分離效果的影響。由于有機(jī)酸中的羧基可與色譜柱固定相中的硅醇?xì)埢l(fā)生相互作用，在使用乙腈-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，奎寧酸和綠原酸等有機(jī)酸的色譜峰出現(xiàn)分裂或變寬拖尾現(xiàn)象；盡管在ESI-電離模式下，使用酸性的流動(dòng)相體系會(huì)抑制目標(biāo)物的電離，導(dǎo)致響應(yīng)降低，但各目標(biāo)物峰形較好，尤其是乙腈-甲酸體系，目標(biāo)物峰形尖銳對(duì)稱。比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)相對(duì)目標(biāo)物洗脫的影響，結(jié)果顯示，采用乙腈洗脫，目標(biāo)物的分離效果和峰形均優(yōu)于甲醇體系，因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水（體積分?jǐn)?shù)）作為流動(dòng)相體系。通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序，使各目標(biāo)物的分離效果和響應(yīng)值達(dá)到最佳，目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化的儀器條件下的總離子流色譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 不同色譜柱對(duì)待測(cè)物的分離效果Fig.2 Separation result of different column

圖3 目標(biāo)物的總離子流色譜圖Fig.3 TIC chromatogram of target compounds

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系和檢出限

按 1.1 配制濃度分別為 0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mg/L的系列目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按本試驗(yàn)確定的儀器條件（1.3）進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)（y），以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得各目標(biāo)物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。

對(duì)涼茶樣品進(jìn)行加標(biāo)，經(jīng)前處理后對(duì)樣液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)信號(hào)噪音比3（S/N=3）和稀釋倍數(shù)計(jì)算方法檢出限（LOD）。

5種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限見(jiàn)表3。可見(jiàn)，各目標(biāo)物在0.02 mg/L～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0；方法檢出限為 0.2 mg/L～0.5 mg/L。

2.2.2 方法回收率和精密度

選取涼茶樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行6次，計(jì)算方法回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限Table 3 Equation of linear correlation，correlation coefficient and the method detection limit（LOD）of target analytes

表4 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 4 Determination results of recoveries and precisions（n=6）

在添加濃度范圍內(nèi)，5種目標(biāo)物的平均回收率為86.3%～102%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為2.4%～8.7%。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用建立的方法，對(duì)市售5份涼茶樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，以驗(yàn)證方法的適用性，各樣品中有機(jī)酸和黃酮類化合物的含量見(jiàn)表5，所測(cè)5份樣品均檢出了奎寧酸和綠原酸，4份樣品含有甘草苷，1份樣品含有柚皮苷，均未檢出槲皮素。其中樣品3（感冒茶）的總離子流色譜圖見(jiàn)圖4。

表5 樣品中目標(biāo)物的測(cè)定情況Table 5 Determination reslults of target compounds in samples

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定涼茶中5種有機(jī)酸和黃酮類化合物的方法，樣品經(jīng)高速離心后，用甲醇稀釋，過(guò)濾，UPLC-MS/MS電噴霧負(fù)離子電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，目標(biāo)物以保留時(shí)間和特征離子對(duì)定性，外標(biāo)法定量。本方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)，適用于涼茶等植物飲料中有機(jī)酸和黃酮類化合物的檢測(cè)。

圖4 實(shí)際樣品的總離子流色譜圖Fig.4 TIC chromatogram of real sample

[1]游飛祥,韓彥琪,龔蘇曉,等.HPLC-Q-TOF-MS分析植物涼茶中的化學(xué)成分[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2016,37(8):161-165

[2]梁慧,鄧潔薇,楊運(yùn)云.高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)癍痧涼茶的化學(xué)成分鑒定及指紋圖譜研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2014,33(2):144-149

[3]陳意光,鄧穗興,柯振華,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定果汁中13種有機(jī)酸和白藜蘆醇[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(12):1387-1390

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[10]彭振磊,張育紅,王川.石化廢水中低碳有機(jī)酸的毛細(xì)管電泳分析[J].分析試驗(yàn)室,2015,34(7):850-854

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Quantitative Analysis of Organic Acid and Flavonoid in Herbal Tea by UPLC-MS/MS

HAN Wan-qing，WANG Bin，WANG Li，XIAN Yan-ping*
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Guangzhou），Guangzhou Key Laboratory of Detection Technology for Food Safety，Guangzhou Research Centre of Risk Dynamic Detection and Early Warning for Food Safety，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

A method for quantitative analysis of 5 kinds of organic acid and flavonoid compounds in herbal tea by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）was developed.Samples were centrifuged，diluted with methanol，and separated on BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column with acetonitrile-0.1%formic acid solution as mobile phase by gradient elution.Quantitative analysis was performed by a triple quadrupole MS system with negative electrospray ionization（ESI-）operated under multiple reaction monitoring（MRM）mode.The method showed a good linearity with correlation coefficients（r）larger than 0.999 0 at the concentration of 0.02 mg/L-0.5 mg/L.The limits of detection（LOD）of the method ranged 0.2 mg/L-0.5 mg/L.At the spiked level of 1.0 mg/L-40 mg/L，the average recoveries presented 86.3%-102%，with the relative standard deviation（RSD，n=6）values varied between 2.4%-8.7%.

herbal tea；organic acid；flavonoid；ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.025

廣東省質(zhì)監(jiān)局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015CZ13）；廣州市質(zhì)監(jiān)局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015kj01）

韓婉清（1987—），女（漢），工程師，碩士，從事產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。

*通信作者

2017-01-20