米曲霉菌株NJ132液態發酵產孢子條件初步篩選

游見明，呂開斌，曹新志

（四川理工學院生物工程系，四川自貢643000）

米曲霉菌株NJ132液態發酵產孢子條件初步篩選

游見明，呂開斌，曹新志

（四川理工學院生物工程系，四川自貢643000）

對影響米曲霉菌株NJ132分生孢子生成的因素進行了比較。結果表明，NJ132菌株液態發酵分生孢子產生的適宜條件為：馬鈴薯培養基添加10 mg/L混合無機鹽作為培養基，用容積300 mL的三角瓶裝瓶裝培養基120 mL，搖床轉速為100 r/min，在溫度25℃下暗培養5 d，第6天轉入20℃、光照/黑暗循環（4 h周期）條件下培養至第7天。

米曲霉；分生孢子；液態發酵；發酵條件

對傳統的白酒生產工藝的改革中，節能、減排、提高原料淀粉的利用率、增加出酒率等，一直以來都是行業不懈追求的目標。如對發酵原料進行膨化預處理來提升淀粉類物質的糖化率，在某些酒類產品（如啤酒、酒精[1]）生產上，已獲得進展，在白酒的生產上也在進行類似的研究[2]。在進行膨化操作過程中，將糖化菌孢子添加到原料中，通過膨化操作過程，使菌種孢子充分混于發酵原料內部，有利于糖化操作環節的進行，利于原料淀粉的降解。

本文基于該過程對糖化菌孢子的需求，以馬鈴薯培養基為基礎，對As.oryzae菌株NJ132液態發酵產分生孢子的適宜條件進行選擇，為開展大量獲得菌株孢子的研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

以四川省自貢市光大街菜市場民間作坊制作的甜酒曲為原料分離獲得的耐熱糖化酶菌株，屬米曲霉，菌株號NJ132，由四川理工學院發酵工程實驗室保存。

1.1.2 基礎培養基

PDA 培養基[3]。

1.1.3 儀器與試劑

THZ-100恒溫搖瓶培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LED雙目顯微鏡：麥克奧迪儀器公司；JB5374-91電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠產品；MT-250恒溫培養箱：上海和羽良電子有限公司；血球計數板：玉環縣五金光學儀器廠。

硫酸鐵、氯化鋅、氯化錳、硫酸鎂：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 孢子計數

用血球計數板計數孢子懸液中的孢子數[4]。

1.2.2 孢子懸液制備

接種NJ132于PDA培養基上，于25℃培養7 d，待霉菌產生大量分生孢子后，在平板中加入10 mL 0.1%的tween-80溶液，用接種環刮取分生孢子，分離懸液，于10 000 r/min離心10 min，沉降物用5 mL無菌生理鹽水充分振蕩將孢子制成懸液，再稀釋成1×107個/mL孢子懸液備后續試驗接種用。

1.2.3 單因素試驗[5-6]

影響NJ132產生孢子的因素包括培養基成分、pH值、培養溫度、通氣、光照等。

在300 mL的三角瓶中加入100 mL培養液，接種1 mL孢子懸浮液，進行以下單因素培養試驗，培養時間為7 d，無光照，對產孢子情況進行觀察計數。

1.2.3.1 培養基成分試驗

在基礎培養基中添加無機鹽等培養基構成成分以觀察培養基構成成分對孢子形成的影響情況。碳源選用葡萄糖，添加量為10 g/L；無機鹽包括：FeSO4、MnCl2、ZnCl2、MgSO4，添加量為 10 mg/L。接種后于 25 ℃恒溫條件下培養。

1.2.3.2 培養條件試驗

pH值影響：前期培養試驗表明，菌株培養較適宜的pH值在6.0在左右。本試驗中，用1 mol/L HCl溶液調節基礎培養基pH值為6.0，接種后于25℃條件下培養。

溫度影響：基礎培養基接種后，于25℃恒溫條件下培養至5天后，改變培養溫度為20℃。

通氣供氧影響：基礎培養基接種后，將搖床轉速設定為80 r/min，于25℃條件下培養。

光照影響：基礎培養基接種后，于25℃恒溫培養，在培養的第6天開始，用3 W熒光燈20 cm進行光照處理，處理過程為光照/黑暗交替，變換頻率為4 h，處理2天后結束培養，對培養物進行觀察比較以明確光照是否對產孢有影響。

試驗對照培養為：在300 mL的三角瓶中加入100 mL基礎培養液，接種1 mL孢子懸浮液，于25℃暗培養7 d，對產孢子情況進行觀察計數。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇與菌株產孢子的影響顯著的光照、溫度、無機鹽、搖床轉速4個因子，進行四因素三水平進行正交試驗。見表1。

表1 NJ132產孢子正交試驗Table 1 The orthogonal test of spore production of NJ132

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

以基礎培養基為對照，就可能影響菌株分生孢子產生的各因素分別進行的對比試驗情況如下。

2.1.1 培養基成分的影響

以基礎培養基培養作為對照，對比添加各種無機鹽對孢子生成的影響情況，借助DPS數據處理系統進行平均數student t檢驗，結果見表2。

表2 培養基成分對孢子產生的影響Table 2 Effects of medium composition on spore production

從添加的幾種無機鹽的結果可以看出，無機鹽對菌株產孢子有顯著影響，從平均數數據看，在基礎培養基之上添加無機鹽對孢子生成具有促進作用。進一步就個不同不同無機鹽之間的影響情況進行分析，發現在這幾種無機鹽之間，MnCl2與ZnCl2之間存在顯著差異（DPS統計軟件分析，p=0.031 9），而其余的各種無機鹽之間不存在差異。根據這種情況，試驗中將多種無機鹽等量混合后添加于基礎培養基進行正交試驗。

2.1.2 培養條件對孢子生成的影響

改變各種培養條件對菌株產孢子的影響情況見表3。

表3 培養條件對孢子產生的影響Table 3 Effects of culture conditions on the spore production

根據表中顯示的結果可以看出，在所選擇的幾種可能對菌株產孢子有影響的因素中，pH值在所選的情況下，對孢子形成沒有顯著影響。溫度條件和通氣狀況及光照因素的影響最為顯著。

2.2 正交試驗結果

單因素的試驗結果表明，在NJ132菌株產孢子培養過程中，對產分生孢子具有顯著影響的因素有無機鹽添加、溫度刺激、光照刺激、通氣條件。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal test

正交試驗結果的極差分析顯示，在對菌株產孢子具有影響的幾個因素中，溫度是最重要的，其次是添加無機鹽，通氣狀況和光照影響依次為第三和第四影響因素。根據各因素的優選水平為初步確定的培養方案為：在培養周期的后階段（5 d開始）將溫度由原來的25℃降為20℃；在馬鈴薯培養基基礎上，復合無機鹽添加量為10 mg/L；通氣量：容積為300 mL的三角瓶中加入100 mL培養液，搖床轉速100 r/min；光照：在培養周期前5 d采取黑暗培養，后2 d采用間隔4 h的光照處理。

表5 極差分析Table 5 Range analysis

3 結論

糖化酶菌株NJ132在馬鈴薯液體培養基上產孢子的能力可以通過培養條件的控制得到提升。從本試驗的情況看，在不考慮碳源、氮源的情況下，添加一定量的無機鹽對孢子生成能力有提升。無機鹽在菌株生長代謝過程中具有多方面的功能，如調節代謝、參與原生質結構、平衡滲透壓等。試驗中添加的無機鹽可能是通過對菌株的生長代謝起到了促進作用來提升包子產生能力的。微生物的孢子生成是由于生長環境出現變化，在惡劣的環境下出現的保護性適應，在培養周期的前階段，環境條件適合菌株生物量積累。到培養周期后階段時，環境條件變化后，不再適合其進行營養生長而轉入孢子生成，在這個階段，人為改變一些環境因素，在這些刺激因素影響下，菌株產孢子的能力得以促進。試驗中通過在培養后期降低培養溫度、利用光線刺激等措施，能夠實現菌株產孢子能力的有效提升。

4 討論

影響微生物菌株產孢子能力的因素很多，這方面的文獻較多[4-7]。本次試驗設計較為粗略，在于對孢子培養條件進行初步探索，實驗結果對該菌株孢子的培養調控因素具有方向性指示作用，進一步的試驗將考慮以下因素：對于無機鹽需要進行更多種類的選擇；不同的無機鹽種類之間可能存在的拮抗關系。在光照方面，需要將光照強度進行量化，同時還需考慮不同波長的光照可能帶來不同的刺激效果；溫度因素中，本次試驗選擇的不同水平間跨度較大。同時，溫度變化的時間點控制上還有待更為準確的試驗加以確認；至于溶氧控制方面，在培養周期不同階段對溶氧量的控制，對孢子生成能力的影響情況都還需要進一步試驗確認。本試驗雖然只是實驗室內的小規模試驗，但對進一步深入研究和大規模發酵生產都具有一定的指導意義。

[1]李大和.試論四川小曲酒的工藝和風味特征[J].食品與發酵工業,1991(1):49-53

[2]郭景峰,孫躍飛,宇曉昱.利用膨化技術對米糠保鮮處理[J].飼料工業,2005(9):45-46

[3]J薩姆布魯克D W拉塞爾.分子克隆實驗指南[M].北京:科學出版社,2008

[4]黃秀梨.微生物學實驗指導[M].北京:高等教育出版社,1996:1-7,35-38,114

[5]莊敬華,高增貴,劉限,等.不同發酵條件對木霉產孢類型的影響[J].中國生物防治,2005,21(1):37-40

[6]陳勝軍,王艷麗,張震,等.稻粒黑粉菌冬孢子萌發影響因素及其產孢培養基的篩選[J].江農業學報,2011,23(3):572-576

[7]高克祥,項存梯,駱會欣,等.木霉菌株T88生物學特性的研究[J].東北林業大學學報,1995,23(2):33-39

[8]高克祥,劉曉光,陳晉江,等.木霉菌株T95生物學特性的研究[J].河北林果研究,1998,13(4):359-366

[9]呂紅線.釀酒酵母子囊孢子形成條件的研究[J].山東輕工業學院學報,1999,13(2):57-60

[10]池玉杰,伊洪偉,吉海龍.長枝木霉菌株T05液態發酵產孢和菌絲生物量條件的篩選[J].東北林業大學學報,2016,44(1):110-113

Preliminary Screening of the Fermentation Conditions of Spore Producing by Liquid Fermentation of the As.oryzae NJ132

YOU Jian-ming，Lü Kai-bin，CAO Xin-zhi
（College of Bio-engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

The factors affecting the production of NJ132 from As.oryzae were compared.The results showed that the suitable conditions for the production of conidia by liquid fermentation of NJ132 strain were：the potato medium was added with 10 mg/L mixed inorganic salt and 120 mL of the culture medium into triangular bottle，the rotate speed was 100 r/min，at a temperature of 25℃for 5 days in the dark；from the 6th day to the 7th，cultivating under the condition of light/dark cycle of cultivation（cycling per 4 hours）at 20 ℃.

As.oryzae；conidia；liquid fermentation；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.035

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室資助項目（NJ2013-13）

游見明（1966—），男（漢），教授，碩士，從事生物技術教學、科研工作。

2017-01-13