基于高通量測序技術的不同性狀窖泥微生物組成研究

羅雯，張倩穎，廖作敏，張文學,2*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610000) 2(四川大學 錦江學院白酒學院，四川 眉山，620860)

基于高通量測序技術的不同性狀窖泥微生物組成研究

羅雯1，張倩穎1，廖作敏1，張文學1,2*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610000) 2(四川大學 錦江學院白酒學院，四川 眉山，620860)

借助高通量測序技術，探討了新泥、趨老熟、老熟、趨老化、老化等不同性狀窖泥的微生物群落結構組成。結果顯示，趨老熟和老熟窖泥微生物群落的多樣性和豐富度均高于其他3種窖泥，且2者的群落分布特征比較相似。趨老熟、老熟窖泥中梭菌屬(Clostridium)的優勢較為明顯，分別為總水平的17.55%和2.99%，而新泥、趨老化泥、老化泥中則以假單胞菌屬(Pseudomonas)為絕對優勢菌屬，占總水平的69.68%、70.50%和72.84%。該研究初步揭示了不同性狀窖泥的微生物群落結構差異，為研究判斷窖泥性狀的微生物組成提供了參考。

高通量測序；不同性狀；窖泥；微生物組成

窖泥是微生物生長繁殖的載體。在濃香型白酒的釀造過程中，窖泥微生物不斷進行自然選擇與淘汰，最終形成其特有的微生態環境[1]。窖泥微生物對白酒風味物質的形成和各風味成分量比關系的協調具有重要作用[2-3]。研究發現，不同窖齡的窖泥微生物結構差異較大[1]，同一窖池不同部位的微生物組成也有所不同[4]。

岳元媛[5]等人通過傳統方法對瀘州老窖窖泥微生物進行分離鑒定，發現了芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及梭菌屬(Clostridium)的存在。但是，有研究發現，自然環境中可培養的微生物只有0.1%～10%[6]，并且由于窖泥特有的理化性質以及窖泥中厭氧菌大量存在，進一步阻礙了窖泥微生物的分離與鑒定，因此利用微生物純培養技術難以客觀揭示窖泥微生物的多樣性。吳冬梅[7]利用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術可視化表征了窖泥微生物，但是，窖泥特有的腐殖酸等雜質極大地影響了FISH技術的可視化效果，同時，窖泥厭氧菌的生理特性和窖泥對微生物的吸附性導致了定量結果的不精確性。隨著分子生物學的迅速發展，陶勇[8]等利用變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術研究了劍南春不同窖齡窖泥，發現窖泥中的優勢微生物主要分布在厚壁菌門。目前，對不同窖齡窖泥中活性微生物演替規律研究較多[8-10]，對不同性狀窖泥微生物群落結構差異研究較少。高通量測序技術以其成本低、通量高、信息豐富等特點普遍應用于土壤微生物群落結構研究[11]，但是用于窖泥中較少。本研究通過高通量測序技術，研究了新泥、趨老熟、老熟、趨老化、老化5種不同性狀窖泥樣品的微生物群落組成，并通過對比不同性狀窖泥中優勢微生物，為研究影響窖泥質量的微生物指標提供了參考。

1 材料與方法

1.1材料

窖泥樣品：取自四川某知名濃香型白酒生產廠，為了保證窖泥性狀判定的準確性，窖泥性狀結合白酒生產實踐，根據感官和酒廠員工經驗判定。選取5種不同性狀窖泥(新泥、趨老熟泥、老熟泥、趨老化泥、老化泥)進行研究。窖泥樣品為窖底四角和中心取樣，并充分混合。-80 ℃冰箱冷凍保存備用。

1.2高通量測序

1.2.1 基因組 DNA 的提取及檢測

用 Omega土壤試劑盒提取樣品中微生物基因組 DNA，具體提取步驟參見操作說明書。提取后置于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增以及Illumina MiSeq測序

細菌 16S rDNA 的擴增采用引物 520F(5’-barcode+ GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3’)和802R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)。擴增完成后，對PCR產物進行定量。Illumina MiSeq測序委托上海派森諾生物科技有限公司進行。

1.2.3 高通量數據分析

利用Flash軟件[12]連接整合過的雙端序列。根據 barcode回歸樣本，再運用Qiime軟件[13]剔除疑問數列，并對剩下的數列進行統計與分析。為了使操作分類單元(OTU)的分析結果更為可靠，去除豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU[14]。

為了對比不同窖泥樣品中微生物的多樣性，使用Qiime軟件對測序結果進行分析，得出反映微生物群落豐富度的Chao1指數[15-16]和ACE[17]指數，以及反映物種多樣性的Shannon[18-19]指數和Simpson[20]指數。利用HemI軟件分析不同水平上樣品間優勢微生物的差異性。

2 結果與討論

2.1窖泥樣品操作分類單元(OTU)分析

另外，就輻射廣度而言，“綠色原則”相較于將其作為規制民事權利行使的手段，也更顯優勢。《民法總則（草案）》（三次審議稿）第133條在解釋上僅對權利行使發生作用，對其他領域，如權利產生（法律行為效力評價）不發生作用。［8］69《民法總則》在將“綠色原則”提升為基本原則地位之后，預示著該項原則的精神和理念可覆蓋民法全部領域。

對窖泥樣品在不同水平上的操作分類單元進行統計，結果見表1。除了種水平外，其他各分類水平上檢測到OTU數變化趨勢為：新泥轉變為趨老熟泥過程中，OTU數逐漸增加，到趨老熟時OTU達最大值，其后轉變為老熟、趨老化、老化性狀窖泥過程中，OTU持續減少。

表1 不同窖泥樣品在不同分類水平下高通量測序的OTU數

而在種水平上，趨老熟泥OTU最多，趨老化泥次之，而新泥中檢測到的OTU數多于老熟泥和老化泥，老化泥中的OTU數最少。在未分類微生物中，老化泥OTU數最多，推測是人們尚不了解的某些微生物在與優勢菌的競爭中數量不斷增多，這些未知性狀微生物的存在和繁衍導致了窖泥老化。

2.2窖泥樣品菌群Alpha多樣性分析

2.2.1 稀疏曲線

對測序序列進行隨機抽樣，利用抽中的序列及其對應的OTU數繪制稀疏曲線[21-22](圖1)。圖1表明，隨著測序序列的增加，五個樣品的稀疏曲線趨于平緩，表明現有的測序數據量已足以反映樣本及微生物多樣性，無需再增加測序深度。趨老熟泥中微生物的多樣性最豐富，老熟泥次之，而老化窖泥微生物多樣性最低。稀疏曲線的變化趨勢與窖泥樣品在門、綱、目、科、屬5個水平上OTU數的變化趨勢一致，說明了趨老熟窖泥中物種的多樣性最為豐富。

A-新泥;B-趨老熟泥;C-老熟泥;D-趨老化泥;E-老化泥圖1 五個窖泥樣品OTU數的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curve of OTUs in pit mud

2.2.2 窖泥樣品中微生物群落多樣性指數

窖泥中原核生物的組成較為復雜，為了對比不同窖泥樣品中微生物的豐富度和多樣性，根據測序結果計算得出Chao1 指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數。結果見表2。

表2 五種窖泥樣品中微生物群落多樣性指數

根據表2可見，趨老熟窖泥樣品的chao1指數為900.00，ACE指數為1 000.17；而老熟窖泥樣品chao1指數為480.00，ACE指數為554.77。表明趨老熟窖泥樣品群落的豐富度最高、老熟泥次之，而老化泥的群落豐富度最小。根據反映物種多樣性的Shannon指數和Simpson指數可知，5種不同性狀的窖泥樣品中，趨老熟泥的微生物群落多樣性最高，然后依次為老熟泥、新泥、趨老化泥，而老化泥的群落多樣性最低。多樣性指數變化趨勢與除種以外的不同分類水平下OTU數走向一致，即在5種不同性狀窖泥中，趨老熟窖泥微生物豐度最高、種類最豐富，而老化窖泥物種多樣性最低，說明趨老熟、老熟窖泥中的微生物經過長時間的自然選擇與馴化，已適應白酒釀造的特殊環境，因此，可以認為老熟、趨老熟泥中釀酒功能微生物也多于其他3種泥。

2.3窖泥樣品菌群的分類組成分析

在門、綱、目、科、屬、種6個不同分類水平下，不同窖泥樣品含有的微生物類群數量見表3。無論哪種分類水平上，均顯示出趨老熟窖泥微生物類群數最多，老化泥最少。5個樣品共檢測到56個門，其中新泥36個、趨老熟泥38個、老熟泥29個、趨老化泥31個、老化泥23個。對門水平上各樣品的優勢菌門(>1%)進行統計，結果見表4。

表3 窖泥樣品在各分類水平的微生物類群數

表4 窖泥樣品門水平優勢菌種

根據表4，趨老熟窖泥中有10個優勢菌門，其中，厚壁菌門(46.70%)和擬桿菌門(11.03%)含量較高。而老化泥的優勢菌門數量最少，只有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門3個優勢菌門，其中以變形菌門占有絕對優勢(93.78%)。說明老化窖泥中微生物多樣性較為單一，與2.2.2反映物種多樣性的Shannon指數和Simpson指數趨勢一致。

利用HemI軟件對表4進行分析，結果表明，各樣品只在變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門3個微生物菌門存在明顯差異(圖2)。對這3種含量差異較大的優勢菌門進行分析(見圖3)。

A-新泥;B-趨老熟泥;C-老熟泥;D-趨老化泥;E-老化泥圖2 不同性狀窖泥樣品優勢菌門含量差異Fig.2 Dominant microorganism of the samples at the phylum level

圖3 不同性狀窖泥樣品門水平差異較大的優勢菌含量Fig.3 Obviously dominant microorganism in different traits of pit mud at the phylum level

結果表明，趨老熟和老熟泥中厚壁菌門(46.70%、73.11%)和擬桿菌門(11.03%、11.32%)明顯多于新泥、趨老化泥、老化泥，而在新泥、趨老化泥、老化泥中，變形菌門(89.55%、92.53%、93.78%)為絕對優勢菌。根據圖3，可以將本次取樣的窖泥樣品分為兩大類：以變形菌門為主的新泥、趨老化泥、老化泥；以厚壁菌門和擬桿菌門為主的趨老熟泥、老熟泥。由此推測質量較好的泥中厚壁菌門較多而變形菌門較少。胡曉龍[23]在研究不同質量窖泥時，發現優質窖泥中，以厚壁菌門(31.16%)和擬桿菌門(27.51%)為優勢菌門，與本文研究結果一致。王明躍[24]等人在研究20、50、150年窖齡窖泥樣品時發現優勢菌門依次為厚壁菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門，其中，厚壁菌門為絕對優勢微生物，而變形菌門所占比例較小，說明20、50、150年3個窖齡的窖泥樣品質量相對較好，性狀接近本研究中的趨老熟、老熟泥，因此并未檢測到大量的變形菌門。有研究認為，厚壁菌門中含有某些功能型微生物，能代謝產生乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸以及濃香型白酒中主要的香味成分己酸乙酯，擬桿菌門作為趨老熟、老熟窖泥樣品中的第二大優勢菌門，能夠發酵葡萄糖產生相應的有機酸[25-26]。

在目水平，所有窖泥樣品共檢測到原核微生物中217個目。其中優勢菌目有17種，含量占總體原核生物的87.8%。對差異較明顯的優勢微生物進行分析，結果見圖4。

圖4 不同性狀窖泥樣品目水平差異較大的優勢菌含量Fig.4 Obviously dominant microorganism in different traits of pit mud at the order level

新泥、趨老化泥、老化泥中微生物主要為假單胞菌目(Pseudomonadales)和根瘤菌目(Rhizobiales)，分別占整個原核生物的75.12%～78.32%、7.97%～9.44%，而趨老熟、老熟泥則只占了0.39%～1.11%和0.33%～1.06%。趨老熟、老熟窖泥樣品中的優勢菌目主要為梭菌目(Clostridiales)和擬桿菌目(Bacteroidales)，其中梭菌目分別為37.39%、17.52%，擬桿菌目為10.99%、11.19%。胡曉龍[23]在研究不同質量窖泥時，發現梭菌目、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、擬桿菌目、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)為優質窖泥中的優勢微生物；梁會朋等用PCR-DGGE方法發現梭菌目為瀘州老窖老熟窖泥中優勢菌目，而瀘州老窖窖香和部分揮發性成分與梭菌目中的某些微生物的作用密不可分[27]。結合本研究成果，推測梭菌目是保證窖泥質量的基礎。

屬水平，5種不同性狀的窖泥樣品共檢測到614屬。對每個窖泥樣品中核心屬(含量大于1%)進行分析，發現共有34個核心屬(圖5)，集中于8個門。其中，5個窖泥樣品在假單胞菌屬(Pseudomonas)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、梭菌屬(Clostridium)存在明顯差異。在質量較好的趨老熟泥和老熟泥中，梭菌屬優勢較為明顯，分別占總水平的17.55%、2.99%。而在新泥、趨老化泥、老化泥中，假單胞菌屬、蒼白桿菌屬的優勢最為明顯，分別占總水平的69.68%～72.84%、6.58%～8.55%。有文獻報道，梭菌為濃香型白酒生產工業中最重要的功能菌，在厭氧條件下能將有機物轉化為有機酸，并在酶催化反應或者非酶催化反應下，與醇反應，生成丁酸乙酯和己酸乙酯[28-20],即濃香型白酒中重要的呈味物質。根據已有的文獻報道，在窖泥環境中，克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)與甲烷菌(Methanogens)發生共同作用，將醇轉化為乙酸、丁酸、己酸；而永達爾梭菌(ClostridiumLjungdahlii)能將CO、H2轉化乙醇和乙酸乙酯[3-,32]。而關于窖泥老化與假單胞菌屬關系的報道較少，有待進一步研究。

圖5 窖泥樣品中優勢微生物屬水平組成Fig.5 Dominant microorganism of the pit mud samples at the genus level

3 結論

不同性狀窖泥的微生物群落結構差異較大。本文通過高通量測序技術探究五種不同性狀窖泥的微生物群落結構，發現新泥、趨老化泥及老化泥中微生物的分布特征較為相似，而老熟泥和趨老熟泥規律比較一致。質量較好的老熟、趨老熟窖泥中，梭菌屬為主要優勢菌群。而質量一般或者質量較差的新泥、趨老化窖泥、老化窖泥中假單胞菌屬含量較高。

窖泥中含有豐富而復雜的微生物群落組成，通過高通量測序技術能夠克服傳統方法的局限性，更簡單高效地解析窖泥微生物群落結構，了解主要優勢菌的演變規律，對窖泥中微生態結構變化的分析具有重要意義，有利于更好地指導生產實踐，做好養窖和護窖工作，生產更多優質濃香型白酒。

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Researchonmicrobialcompositionofpitmudwithdifferenttraitsusinghigh-throughputsequencing

LUO Wen1,ZHANG Qian-ying1,LIAO Zuo-min1,ZHANG Wen-xue1,2*

1(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610000,China) 2(School of Liquor-making Engineering,Jinjiang College,Sichuan University,Meishan 620860,China)

In order to explore the microbial community structure of pit mud with different traits, microbial compositions of five kinds of pit mud including new pit mud, tending to be aged pit mud, aged pit mud, tending to be aging pit mud and aging pit mud were studied herein by using high-throughput sequencing. The results showed that the distribution characteristics of microbial community in tending to be aged and aged pit muds were similar. Besides, the diversity and abundance of microbial communities in those two pit muds were higher than that in other pit muds.Clostridiumwas the predominant genera in tending to be aged and aged pit muds, which was 17.55% and 2.99%, respectively. While Pseudomonas was the predominant genera in new, tending to be aging and aging pit muds, accounting for 69.68%, 70.50% and 72.84%. This research preliminarily revealed the microbial community structure of pit mud with different traits, which provided a reference for studying microbial pointers to determine the properties of pit mud.

high-throughput sequencing；different traits；pit mud；microbial composition

碩士研究生(張文學教授為通訊作者，E-mail：foodbiotech@126.com)。

國家自然科學基金(31571824)

2017-05-15，改回日期：2017-05-31

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014763